[發明專利]增強子Hr3在促進hycu-ep32蛋白增量表達中的應用

有效

• 申請號: 201110423273.3
• 申請日: 2011-12-16
• 公開（公告）號: CN102492691A
• 公開（公告）日: 2012-06-13
• 發明（設計）人: 夏慶友;蔣亮;程廷才;金盛凱;徐漢福;王根洪
• 申請（專利權）人: 西南大學
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/63;C12N15/66;A01K67/04
• 代理公司: 北京同恒源知識產權代理有限公司 11275
• 代理人: 趙榮之

技術領域

本發明涉及基因領域，特別涉及家蠶的轉基因技術。

背景技術

轉基因技術是將人工分離和修飾過的基因導入到生物體基因組中，由于導入基因的表達，引起生物體的性狀的可遺傳的修飾。轉基因技術是現代生物學研究中的一項重要的技術，在功能基因研究、生物素材創新、現代遺傳育種等方面發揮著重要的作用。

家蠶是具有重要經濟價值的鱗翅目昆蟲，蠶絲業每年為蠶農創收?100?多億元，蠶絲業為世界經濟、文化、社會發展作出了重要貢獻。但是，當家蠶遭遇病毒侵害，通常會造成蠶業的巨大損失。據統計，我國養蠶業最為發達的幾個主產區，每年因病毒性疾病所造成的損失，約占總蠶病損失的?70-80%。其中家蠶核型多角體病毒病又是三大病毒病中最常見﹑危害最嚴重的一類蠶病,該病傳染性極強，難以控制。

引起核型多角體病毒病的病原為家蠶核型多角體病毒(Bombyx?mori?Nuclear?Polyhedrosis?Virus,BmNPV),?BmNPV屬于桿狀病毒科，真桿狀病毒亞科,核型多角體病毒屬,病毒粒子呈桿狀，全基因組大小為128413bp；病毒結構主要由外層的囊膜和內層的核衣殼組成，在不同感染時期分別以出芽型病毒粒子(budded?virus,BV)和包埋型病毒粒子(occluded?virus,OV)兩種形態存在，而多角體是在感染細胞的核或質中產生的包含和保護病毒粒子的一種蛋白質結晶，很穩定。多角體病毒對不良環境﹑消毒藥劑等有較強的抵抗性，在環境中可以長期存活，但極易溶于堿性溶液；當家蠶食下多角體病毒，在中腸強堿性消化液(pH9.2～9.4)作用下多角體被溶解，釋放的病毒粒子OV借囊膜與中腸上皮細胞微絨毛膜的融合作用脫去囊膜，核衣殼進入中腸細胞開始原發感染(Primary?infection)，在細胞內復制核衣殼并通過“出芽”方式產生BV進入血體腔，繼而感染其他組織細胞。最終，蠶體多以體壁破裂，流出病毒多角體濃汁而死。病毒多角體濃汁中含有大量的病毒粒子，污染蠶座環境，使得周圍健康蠶感染病毒。可見，家蠶核型多角體病毒病是蠶業生產中的一個重要的危害原，一旦產生，極易爆發。

由于家蠶核型多角體病毒病在蠶業生產中危害重大，蠶業界一直希望能夠培育出對此病毒具有較高抗性的蠶品種。但是，由于目前病毒致病分子機制研究較少，加之抗性品種培育手段多采用傳統的遺傳篩選的辦法，周期長而且定向性差，所以收效甚微。

轉基因技術在生物素材創新、現代遺傳育種等方面發揮著重要的作用，自2000年日本科學家報道首次成功培育轉基因家蠶以來，國內外已陸續報道轉基因家蠶成功的消息。目前已經有報道外國學者嘗試通過轉基因干涉病毒基因的方法來提高家蠶的抗性，他們利用的是家蠶多化性品系的非滯育卵，主要是因為多化性家蠶品種所產的卵為生種卵，其不需要任何的人工處理便能夠在適當的溫濕度下連續發育直至孵化，這個特點極大地方便了轉基因實驗中的操作控制。但是，通過轉基因干涉利用多化性家蠶品種制備的抗病毒品系具有以下兩個方面明顯的缺陷：①生產用種普遍為二化性滯育種，用多化性家蠶品種制備的抗病毒品系不利于生產推廣，同時與滯育性的家蠶品種相比較，多化性家蠶品種不具有滯育期，對其繼代維持只能依靠連續的飼養繁殖，這樣需要耗費大量的人力物力對獲得的轉基因家蠶品系進行維持和繼代，同時也大大增加了獲得的轉基因家蠶品種資源丟失的風險。②轉基因干涉品系只能在mRNA水平發揮作用，不能在病毒DNA復制和蛋白合成水平發揮作用。因此，利用家蠶滯育品種，制備一種能在病毒DNA復制和蛋白合成水平抑制病毒增殖的轉基因品系是一個有效可取的方法。

先前的研究結果顯示，當家蠶核型多角體病毒（BmNPV）和美國白蛾核型多角體病毒（HycuNPV）共轉染BmN-4細胞，BmNPV在BmN-4細胞中的增殖將受到抑制，HycuNPV編碼的hycu-ep32基因與BmNPV的增殖被抑制有關。家蠶自身抗性的有限導致宿主對抗性蛋白的大量需求。然而，遺憾的是，家蠶自身體內并不存在Hycu-EP32?蛋白。BmNPV的同源重復區(homologous?regions，hr3)具有復制起始位點的功能，可以對啟動子行使增強子功能。在細胞水平，Hr3增強子能使啟動子的活性增強幾倍，而Hr3+BmNPV的IE1蛋白能使啟動子的活性增強上千倍。BmNPV的39kP啟動子具有明顯的BmNPV誘導啟動活性，能使家蠶在受到BmNPV侵染的時候啟動下游基因的表達。