[發(fā)明專利]增強(qiáng)子Hr3在促進(jìn)hycu-ep32蛋白增量表達(dá)中的應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110423273.3
• 申請(qǐng)日: 2011-12-16
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102492691A
• 公開(kāi)（公告）日: 2012-06-13
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 夏慶友;蔣亮;程廷才;金盛凱;徐漢福;王根洪
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 西南大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/113
• 分類號(hào): C12N15/113;C12N15/63;C12N15/66;A01K67/04
• 代理公司: 北京同恒源知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11275
• 代理人: 趙榮之

1.增強(qiáng)子Hr3在提高h(yuǎn)ycu-ep32蛋白表達(dá)量中的應(yīng)用，所述增強(qiáng)子Hr3的核苷酸序列如SEQ?ID?NO:1所示。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，增強(qiáng)子Hr3在介導(dǎo)39kP啟動(dòng)子提高h(yuǎn)ycu-ep32蛋白表達(dá)量中的應(yīng)用，所述39kP啟動(dòng)子的核苷酸序列如SEQ?ID?NO:2所示。

3.增量表達(dá)載體，其特征在于，所述增量表達(dá)載體以轉(zhuǎn)座載體pBac[3×P3-EGFP?afm]為基礎(chǔ)載體，依次連接有增強(qiáng)子Hr3、39kP啟動(dòng)子、hycu-ep32基因和終止信號(hào)序列。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的增量表達(dá)載體，其特征在于，所述hycu-ep32基因?yàn)?i>hycu-ep32基因全長(zhǎng)序列，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO:3所示。

5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的增量表達(dá)載體，其特征在于，所述終止信號(hào)序列為SV40，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO:4所示。

6.權(quán)利要求3所述的增量表達(dá)載體的制備方法，其特征在于，具體包括以下步驟：

A）??39kP-1180載體的構(gòu)建

將如SEQ?ID?NO:2所示的39kP啟動(dòng)子用SalⅠ?和BamHⅠ進(jìn)行雙酶切，得39kP啟動(dòng)子酶切片段，同時(shí)用SalⅠ和BamHⅠ酶切pSLfa1180fa載體，得pSLfa1180fa載體酶切片段，連接39kP酶切片段和pSLfa1180fa載體酶切片段，得39kP-1180載體；

B?）39kP-hycu-ep32-1180載體的構(gòu)建

將核苷酸序列如SEQ?ID?NO:3所示的hycu-ep32基因分別用?BamHⅠ和?NotⅠ進(jìn)行雙酶切，得hycu-ep32酶切片段，同時(shí)用BamHⅠ和NotⅠ酶切39kP-1180載體，得pSLfa1180fa-39kP載體酶切片段，連接hycu-ep32酶切片段和pSLfa1180fa-39kP載體酶切片段，得39kP-hycu-ep32-1180載體；

C?)?39kP-hycu-ep32-SV40-1180載體的構(gòu)建

NotⅠ和Hind?Ⅲ雙酶切含有如SEQ?ID?NO:4所示的終止信號(hào)的1180載體，得到終止信號(hào)酶切片段，同時(shí)用NotⅠ和Hind?Ⅲ雙酶切步驟B所得39kP-hycu-ep32-1180載體，得到39kP-hycu-ep32-1180酶切片段，將終止信號(hào)酶切片段和39kP-hycu-ep32-1180酶切片段進(jìn)行連接，得39kP-hycu-ep32-SV40-1180,如SEQ?ID?NO:5所示；

D)?Hr3-39kP-hycu-ep32-SV40-1180

將如SEQ?ID?NO:1所示?增強(qiáng)子Hr3用NcoⅠ進(jìn)行單酶切，得增強(qiáng)子Hr3酶切片段，同時(shí)將步驟C所得的39kP-hycu-ep32-SV40-1180用NcoⅠ進(jìn)行單酶切，得39kP-hycu-ep32-SV40-1180酶切片段，將所述增強(qiáng)子Hr3酶切片段和39kP-hycu-ep32-SV40-1180酶切片段進(jìn)行連接，得Hr3-39kP-hycu-ep32-SV40-1180,其核苷酸序列如SEQ?ID?NO:6所示；

E)?pBac[Hr3-39kP-hycu-ep32-SV40-3×P3-EGFP?afm]的構(gòu)建

?用限制性內(nèi)切酶AscⅠ酶切步驟D所得Hr3-39kP-hycu-ep32-SV40-1180載體，得Hr3-39kP-hycu-ep32-SV40片段；同時(shí)用內(nèi)切酶AscⅠ單酶切piggyBac[3×p3?EGFP?afm]，得piggyBac[3×p3?EGFP?afm]線性片段，將Hr3-39kP-hycu-ep32-SV40片段和piggyBac[3×p3?EGFP?afm]連接，得增量表達(dá)載體，命名為pBac[Hr3-39kP-hycu-ep32-SV40-3×P3-EGFP?afm]。