[發明專利]針對亞細亞鐮刀菌的分子檢測方法及其應用

有效

• 申請號: 201110422147.6
• 申請日: 2011-12-15
• 公開（公告）號: CN102559873A
• 公開（公告）日: 2012-07-11
• 發明（設計）人: 張旭;周永進;馬鴻翔;余桂紅;孫曉波;王磊;邢錦城
• 申請（專利權）人: 江蘇省農業科學院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司 32200
• 代理人: 孫忠浩

技術領域

本發明涉及一種針對亞細亞鐮刀菌的分子檢測方法及其應用，屬于作物病害診斷和病原菌鑒定的技術領域。

背景技術

由鐮刀菌(Fusarium?spp.)引起的小麥赤霉病(Fusarium?head?blight，FHB)是一種廣泛流行的世界性病害，主要發生于溫暖濕潤地區，是影響小麥高產、穩產和優質的重要因素之一。19世紀90年代以來，北美、歐洲、亞洲等地大麥、小麥赤霉病災情嚴重。我國南方長江中下游冬麥區發生嚴重，隨著全球性氣候變暖、耕作制度以及耕作方式的改變，小麥赤霉病正向黃淮麥區、北方麥區以及西南和西北麥區擴展(Ma等，2008)，幾乎蔓延到所有小麥種植區。2003年，長江中下游地區60-80％的麥區感染赤霉病，減產超過20％。2005年，江蘇省赤霉病的發生面積為1800萬畝左右，占全省總種植面積的72％。全國農業技術推廣服務中心預報2011年赤霉病在全國流行面積為6500萬畝。

小麥赤霉病的發生與流行還帶來巨大的食品安全性隱患。鐮刀菌可以產生單端孢霉烯毒素(trichothecene)，人畜食用受赤霉病真菌毒素污染的面粉會發生嘔吐、腹瀉及食欲不振等急、慢性中毒癥狀，嚴重者可導致死亡(陸維忠等，2001)。據美國估計，因此類毒素污染所造成的直接經濟損失僅1991～1996年間就高達三億美元。我國、歐盟和美國、加拿大均要求面粉、面包、餅干等食品中DON毒素的限量標準為1000μg/kg(1ppm)(Buerstmayr等，2009；GB?16329-1996)。因此，明確我國小麥赤霉病致病菌的種類與產毒類型，對開展小麥赤霉病防治與抗病育種都有重要的實踐意義。

自20世紀40年代中國首次報道小麥赤霉病以來，國內外研究認為，禾谷鐮刀菌(Fusarium?graminearum?Schwabe)是小麥赤霉病的主要致病菌之一，也是中國小麥赤霉病的優勢致病菌。近年來的研究表明，F.graminearum是一個含有許多特定種系的復合種(Fg?Complex)，O’Donnell通過系統發生學分析，將FgComplex劃分成13個特定的正式命名的種。根據該項研究結果，目前中國小麥赤霉病的主要致病菌為禾谷鐮刀菌(Fusarium?graminearum)和亞細亞鐮刀菌(Fusariumasiaticum)。其中亞細亞鐮刀菌在長江中下游麥區、南方麥區和西南麥區均為優勢致病菌，并且不斷向黃淮麥區、北方麥區遷移(Zhang，2010)。研究還表明，產生3ADON毒素的亞細亞鐮刀菌群日益擴展，并具有更強的致病力，危害性更大(Zhang，2010)。因此，快速、準確鑒定檢測亞細亞鐮刀菌，有利于針對性地加強對小麥赤霉病的防治。

傳統的鐮刀菌鑒定方法主要通過形態學，如大分子生孢子、小分生孢子、原膜孢子等的形態來鑒定。但形態學鑒定方法繁瑣，沒有統一的規范標準，并且需要豐富的實踐經驗。隨著遺傳與分子生物學技術的迅速發展，營養體親合群(Vegetative?compatibility?group?VCG)，分子標記也成為鑒定鐮刀菌的主要技術手段。與常規的形態鑒定法相比，分子標記能準確、快速地從混合群體中鑒定出不同病菌類型，為準確、快速分析病菌的群體分布、特點和鑒定診斷提供新方法。

Nicholson等(1998)找到了一對鑒定禾谷鐮刀菌Fg?Complex的標記Fg16F/R，但在擴增來自不同地區的禾谷鐮刀菌株時得到6種PCR產物，不能有效地區分菌株的種類。Qu等(2008)利用該對引物，并結合AFLP標記，鑒定出Fg16F/R擴增類型5和AFLP擴增類型B的菌株為亞細亞鐮刀菌。由于AFLP標記操作繁瑣，且涉及到酶切和兩次PCR擴增等步驟，難以在實際檢測中推廣應用。Yang等(2008)利用氨連接酶基因的單核苷酸多態性(SNP)設計了4個引物試圖來區分Fg?complex中的七個種，其中鑒定亞細亞鐮刀菌需要擴增出536bp、388bp、311bp、162bp等4條不同大小的條帶，并且還需要通過條帶的強弱進行輔助判斷，并不能真正滿足快速簡易檢測的要求。

目前，一種針對所有亞細亞鐮刀菌具有特異性的引物，未見報道。

發明內容

本發明的目的在于：針對目前對亞細亞鐮刀菌的鑒定方法過于復雜，或只能針對個別亞細亞鐮刀菌，在預防亞細亞鐮刀菌對農作物和飼料污染，以及在鑒別病原菌等一系列實際應用中存在明顯的局限性的實際問題，提供一種由新的特異性引物組成的針對亞細亞鐮刀菌的分子檢測方法及其應用。