[發明專利]血小板生成素模擬肽二聯體與人血清白蛋白的融合蛋白及其制備方法和應用

無效

• 申請號: 201110420870.0
• 申請日: 2011-12-15
• 公開（公告）號: CN102408485A
• 公開（公告）日: 2012-04-11
• 發明（設計）人: 王軍平;申明強;許楊;陳芳;陳默;王崧;王艾平;粟永萍
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第三軍醫大學
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N15/63;C12N1/19;C12N1/21;C12N5/10;A61K38/38;A61K38/10;A61P7/04;C12R1/19;C12R1/84
• 代理公司: 重慶志合專利事務所 50210
• 代理人: 胡榮琿

技術領域

本發明屬于生物技術與基因工程制藥領域，具體涉及血小板生成素模擬肽二聯體與人血清白蛋白的融合蛋白及其制備方法和應用。?

背景技術

在臨床上常會遇到由各種原因引起的原發性和繼發性血小板減少癥，如原發性血小板減少性紫癜、再生障礙性貧血以及腫瘤化/放療造成的血小板減少等。對于這類疾病，比較適合應用長效升血小板藥物進行救治，一方面，可以減少用藥次數，使病人的針痛之苦減少；另一方面，可以減少藥物用量，降低治療費用。?

血小板由巨核細胞產生，促進巨核細胞的增殖、分化是提高血小板水平的主要手段。血小板生成素(Thrombopoietin，TPO)，又稱巨核細胞生長發育因子(MGDF)，是骨髓巨核細胞增殖、分化和血小板生成的最重要調控因子。1994年TPO基因被首次成功克隆后不久，人們即研制出一種聚乙二醇化的重組功能型TPO基因工程產品-PEG-rHuMGDF。動物實驗結果表明，PEG-rHuMGDF不僅具有突出的促血小板生成活性，而且在體內具有較長的半衰期，單次應用即可達到顯著升高血小板的效果。然而，在臨床試驗過程中人們發現，一些健康受試者在接受該藥物治療后所產生的抗體與內源性TPO存在交差中和反應，導致受試者出現血小板減少，從而使得PEG-rHuMGDF乃至重組人TPO的研制在1998年時即被美國FDA叫停。受其影響，在美、歐、日本等國家至今重組人TPO都未被批準進入臨床。鑒于此，人們轉而尋找和開發TPO的模擬物或類似物，以期研制出新一代的升血小板藥物。所謂TPO的模擬物或類似物是指：與TPO一樣具有結合并激活TPO受體、促進巨核細胞增殖、分化和血小板生成的功能，但又與TPO完全不同源的多肽或化合物。?

1997年Cwirla等(Cwirla?SE?et?al.，Science，1997，276：1696-1699)通過噬菌體展示技術篩選到一種可特異性結合并激活TPO受體的短肽，該短肽由14個氨基酸殘基組成，其化學合成的二聯體多肽與TPO受體的親和力以及促巨核細胞增殖活性都與重組人TPO相當，但其氨基酸序列又與天然TPO完全不同源，所以不會誘導體內產生TPO中和性抗體，因此稱之為TPO模擬肽(Thrombopoietin?mimetic?peptide，TMP)。然而，由于TMP二聯體多肽分子量小，在體內的生物半衰期非常短，因此體內應用效果并不理想。為了增大分子量以促進體內應用效果，有研究者嘗試將TMP二聯體的氨基末端共價結合聚乙二醇(Serres?M?et?al.，Stem?Cells，1999，17：203-209)，也有研究者將TMP與免疫球蛋白(IgG)的Fc段進行了融合(EP1144454B1)。?

人血清白蛋白(HSA)是血漿中的主要蛋白成分，約占血漿總蛋白的50-60％。HSA是一種非糖基化單鏈蛋白，共由585個氨基酸殘基組成，其分子量為66.5kDa(A.Dugaiczyk?et?al.，PNAS，1982，79：71-75)，血漿半衰期長達兩周以上。HSA在宿主細胞中是以一種原肽形式合成的，其中含24個氨基酸殘基組成的信號肽和前肽，在轉運和分泌過程中信號肽和前肽被切除。HSA是一個穩定的惰性蛋白，并能作為藥物載體。HSA已成功地在多種宿主中表達(EP330451和EP361991)，尤其在酵母細胞中可實現HSA較高水平的穩定表達。當目的多肽與HSA融合表達時不僅可以提高多肽藥物的穩定性，還可以增加多肽藥物在體內的半衰期。?

發明內容

本發明的目的在于提供一種血小板生成素模擬肽二聯體與人血清白蛋白的融合蛋白及其制備方法和應用。?

本發明所述的血小板生成素模擬肽TMP二聯體與人血清白蛋白HSA的融合蛋白，包含1個人血清白蛋白HSA和2個血小板生成素模擬肽TMP。?

人血清白蛋白HSA存在天然多態性，本發明融合蛋白中的人血清白蛋白HSA也包括這些多態型。?

優選地，所述血小板生成素模擬肽TMP具有SEQ?ID?NO：1所示的氨基酸序?列，或在該氨基酸序列中取代、缺失或插入氨基酸殘基所得到的具有所述血小板生成素模擬肽TMP的活性的氨基酸序列。?

優選地，所述人血清白蛋白HSA具有SEQ?ID?NO：2所示的氨基酸序列，或在該氨基酸序列中取代、缺失或插入氨基酸殘基所得到的具有所述人血清白蛋白HSA的活性的氨基酸序列。?