[發明專利]血小板生成素模擬肽二聯體與人血清白蛋白的融合蛋白及其制備方法和應用

無效

• 申請號: 201110420870.0
• 申請日: 2011-12-15
• 公開（公告）號: CN102408485A
• 公開（公告）日: 2012-04-11
• 發明（設計）人: 王軍平;申明強;許楊;陳芳;陳默;王崧;王艾平;粟永萍
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第三軍醫大學
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N15/63;C12N1/19;C12N1/21;C12N5/10;A61K38/38;A61K38/10;A61P7/04;C12R1/19;C12R1/84
• 代理公司: 重慶志合專利事務所 50210
• 代理人: 胡榮琿

1.一種血小板生成素模擬肽TMP的二聯體與人血清白蛋白HSA的融合蛋白，其特征在于，包含1個人血清白蛋白HSA和2個血小板生成素模擬肽TMP。

2.根據權利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述血小板生成素模擬肽TMP具有SEQ?ID?NO：1所示的氨基酸序列，或在該氨基酸序列中取代、缺失或插入氨基酸殘基所得到的具有所述血小板生成素模擬肽TMP的活性的氨基酸序列。

3.根據權利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述人血清白蛋白HSA具有SEQ?ID?NO：2所示的氨基酸序列，或在該氨基酸序列中取代、缺失或插入氨基酸殘基所得到的具有所述人血清白蛋白HSA的活性的氨基酸序列。

4.根據權利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述人血清白蛋白HSA位于融合蛋白的N-末端，所述2個血小板生成素模擬肽TMP串聯成二聯體位于融合蛋白的C-末端，在人血清白蛋白HSA與血小板生成素模擬肽TMP二聯體之間以及兩個血小板生成素模擬肽TMP之間均設有連接肽L，所述融合蛋白用結構式表示為HSA-L-(TMP)₂。

5.根據權利要求4所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ?ID?NO：3所示，編碼所述融合蛋白的氨基酸序列的DNA序列如SEQ?ID?NO：5所示。

6.根據權利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述2個血小板生成素模擬肽TMP串聯成二聯體位于融合蛋白的N-末端，所述人血清白蛋白HSA位于融合蛋白的C-末端，在人血清白蛋白HSA與血小板生成素模擬肽TMP二聯體之間以及兩個血小板生成素模擬肽TMP之間均設有連接肽L，所述融合蛋白用結構式表示為(TMP)₂-L-HSA。

7.根據權利要求6所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ?ID?NO：4所示，編碼所述融合蛋白的氨基酸序列的DNA序列如SEQ?ID?NO：6所示。

8.根據權利要求4至7中任一項所述的融合蛋白，其特征在于，所述人血清白蛋白HSA與血小板生成素模擬肽TMP二聯體之間以及兩個血小板生成素模擬肽TMP之間的連接肽L均由1-50個氨基酸殘基組成。

9.根據權利要求8所述的融合蛋白，其特征在于，所述人血清白蛋白HSA與血小板生成素模擬肽TMP二聯體之間的連接肽L由1-30個氨基酸殘基組成，兩個血小板生成素模擬肽TMP之間的連接肽L由1-15個氨基酸殘基組成。

10.根據權利要求9所述的融合蛋白，其特征在于，組成所述連接肽L的氨基酸主要是Gly、Ser、Pro、Tyr或Ala。

11.一種權利要求1所述的融合蛋白的制備方法，其特征在于，包含步驟：

1)獲取人血清白蛋白HSA的基因，并將該基因克隆至載體質粒1中，獲得含HSA基因的質粒2；

2)以步驟1)獲得的質粒2為模板，通過PCR擴增得到加載了編碼TMP二聯體序列的PCR產物，將所述PCR產物克隆至載體質粒3并轉化大腸桿菌，獲得含編碼HSA與TMP二聯體的融合蛋白的基因的質粒4；

3)通過限制性內切酶酶切、連接并轉化大腸桿菌，將編碼HSA與TMP二聯體的融合蛋白的基因從質粒4亞克隆至表達載體質粒5中，獲得含編碼HSA與TMP二聯體的融合蛋白的基因的重組表達質粒6；

4)將步驟3)所述的重組表達質粒6轉化到感受態細胞，再轉化到宿主表達系統進行表達，即得所述融合蛋白。

12.根據權利要求11所述的制備方法，其特征在于，步驟1)的質粒1和步驟2)的質粒3均為pUC57質粒；步驟3中的質粒5為pPICZα質粒。

13.根據權利要求11所述的制備方法，其特征在于，步驟4)所述宿主是酵母。

14.一種含有權利要求1所述的融合蛋白的編碼基因的重組表達載體。

15.一種含有權利要求14所述的重組表達載體的宿主表達系統。

16.權利要求1所述的融合蛋白在制備治療原發性或繼發性血小板減少癥的藥物中的應用。