[發(fā)明專(zhuān)利]一種誘導(dǎo)毛脈蓼產(chǎn)生毛狀根的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110420715.9
• 申請(qǐng)日: 2011-12-16
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102517322A
• 公開(kāi)（公告）日: 2012-06-27
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王英娟;步懷宇
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 西北大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12N15/82
• 分類(lèi)號(hào): C12N15/82;A01H5/06
• 代理公司: 西安西達(dá)專(zhuān)利代理有限責(zé)任公司 61202
• 代理人: 謝鋼

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種誘導(dǎo)毛脈蓼產(chǎn)生毛狀根的方法，利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)和轉(zhuǎn)基因技術(shù)通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)毛脈蓼試管苗葉片獲得毛脈蓼毛狀根，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

1982年，Chilton等人首次報(bào)道了發(fā)根農(nóng)桿菌?(Agrobacterium?rhizogenes)?Ri?質(zhì)粒在感染植物細(xì)胞時(shí)，通過(guò)細(xì)菌和植物細(xì)胞之間的附著，Vir基因(virulencegene)的激活和表達(dá)，其T-DNA（transferred?DNA）片段被轉(zhuǎn)移、插入并穩(wěn)定地在植物細(xì)胞基因組中表達(dá)誘導(dǎo)植物細(xì)胞產(chǎn)生毛狀根（hairy?roots)。與培養(yǎng)細(xì)胞相比，毛狀根培養(yǎng)具有激素自主性快速生長(zhǎng)、分化，次生代謝物種類(lèi)多、含量高，遺傳性穩(wěn)定，且在基因轉(zhuǎn)移過(guò)程中無(wú)需標(biāo)記基因等優(yōu)點(diǎn)，使毛狀根在生產(chǎn)植物次生代謝物和傳統(tǒng)中藥材有效成分方面具有很大的工業(yè)化生產(chǎn)潛力，并取得了飛速的發(fā)展。

毛脈蓼（Polygonum?ciliinerve?(Nakai)?Ohwi），亦名朱砂七，別名朱砂蓮、紅藥子，始載于《圖經(jīng)本草》，為蓼科蓼屬的多年生纏繞草本植物，分布于中國(guó)東北及陜西（大巴山）、湖北、四川、貴州等省，海拔200–2700?m。毛脈蓼主要藥用部位為根莖，含食用大黃甙(rhapontin)、蒽醌類(lèi)物質(zhì)及鞣質(zhì)，其味苦、性涼，功能清熱解毒、活血涼血、止血止瀉、去風(fēng)濕、強(qiáng)腰膝，民間廣泛用于治療急性胃痛、胃腸炎、菌痢、扁桃體炎、尿路感染及跌打損傷、風(fēng)濕腰痛等癥，臨床效果顯著，為“太白七藥”之一。

目前毛脈蓼的藥用價(jià)值已經(jīng)得到臨床證實(shí)，有關(guān)毛脈蓼的研究多集中在其藥用有效成分的檢測(cè)分離，未見(jiàn)利用發(fā)根農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的毛脈蓼獲得毛狀根，繼而進(jìn)行其藥用有效成分利用的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是以毛脈蓼葉片外植體為受體，利用含甘露堿型Ri質(zhì)粒的發(fā)根農(nóng)桿菌菌株W.T15834對(duì)其侵染轉(zhuǎn)化，歷經(jīng)共培養(yǎng)、篩選培養(yǎng)、鑒定，誘導(dǎo)和培養(yǎng)獲得毛脈蓼毛狀根。

本發(fā)明的實(shí)現(xiàn)過(guò)程如下：

一種誘導(dǎo)毛脈蓼產(chǎn)生毛狀根的方法，其以毛脈蓼葉片為外植體，通過(guò)發(fā)根農(nóng)桿菌株W.T15834對(duì)其誘導(dǎo)形成毛狀根，培養(yǎng)得到大量毛脈蓼毛狀根。

具體誘導(dǎo)毛脈蓼產(chǎn)生毛狀根的步驟如下：

（1）選取在MS?固體培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)的毛脈蓼20天齡無(wú)菌苗的幼嫩葉片切成1.0?cm²大小的不具葉柄的葉片外植體，置于MS基本培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)24h；

（2）浸入用MS液體培養(yǎng)基稀釋5倍的發(fā)根農(nóng)桿菌W.T15834菌懸液中震蕩，取出外植體，用無(wú)菌濾紙吸去多余菌液并放回原培養(yǎng)基上黑暗共培養(yǎng)5天；

（3）轉(zhuǎn)入MS篩選培養(yǎng)基上，在25℃、每天14h散射光下培養(yǎng)誘導(dǎo)形成毛狀根；

（4）切取從葉片外植體切口中脈處產(chǎn)生的毛狀根，置于MS篩選培養(yǎng)基上除菌培養(yǎng)，每7天繼代一次獲得無(wú)菌毛脈蓼毛狀根；

（5）毛脈蓼毛狀根培養(yǎng)于MS固體或液體培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)，最好在1/2MS液體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)時(shí)間為4周。

所述MS液體培養(yǎng)基組成為：MS?基本培養(yǎng)基，附加30?g/L?蔗糖，pH?為5.8～6.2。

所述MS?固體培養(yǎng)基組成為：MS?基本培養(yǎng)基，附加30?g/L?蔗糖，7?g/L?瓊脂，pH?為5.8～6.2。

所述MS篩選培養(yǎng)基組成為：MS?固體培養(yǎng)基，附加300?mg/L頭胞噻肟鈉，pH為5.8～6.2。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果：

本發(fā)明利用離體培養(yǎng)建立無(wú)菌快繁體系的基礎(chǔ)上，利用發(fā)根農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化毛脈蓼，可以獲得大量毛脈蓼毛狀根。對(duì)于用根的藥用植物而言，根中的次生代謝產(chǎn)物含量高于其他組織，在體外建立根培養(yǎng)體系利于藥用成分的提取利用。本發(fā)明所提供的毛脈蓼毛狀根的誘導(dǎo)和培養(yǎng)方法，具有激素自主性快速生長(zhǎng)、分化，增殖系數(shù)高，遺傳穩(wěn)定，取材方便，不受季節(jié)限制，具有培養(yǎng)時(shí)間短的優(yōu)點(diǎn)，對(duì)于毛脈蓼轉(zhuǎn)基因技術(shù)的完善，為毛脈蓼毛狀根的大量培養(yǎng)及利用后期毛脈蓼毛狀根的次生產(chǎn)物的生物轉(zhuǎn)化具有積極作用。

附圖說(shuō)明

圖1?毛脈蓼毛狀根的誘導(dǎo)和培養(yǎng)，A葉片10d誘導(dǎo)的毛狀根，B?MS固體繼代培養(yǎng)的5?d?的毛狀根，C?MS液體懸浮培養(yǎng)30?d?的毛狀根；

圖2?毛脈蓼毛狀根中甘露堿的檢測(cè)；1：甘露堿標(biāo)品?2：未轉(zhuǎn)化植株根陰性對(duì)照?3~7：不同毛狀根的單克隆；

圖3?毛脈蓼毛狀根rolB基因PCR分析；?M：分子量標(biāo)記?1：Ri質(zhì)粒陽(yáng)性對(duì)照?2：未轉(zhuǎn)化植株的陰性對(duì)照?3~7：不同毛狀根的單克隆；