[發明專利]一種不含抗性標記的豬胸膜肺炎放線桿菌雙基因缺失株、其構建方法及應用

無效

• 申請號: 201110420236.7
• 申請日: 2011-12-15
• 公開（公告）號: CN102517232A
• 公開（公告）日: 2012-06-27
• 發明（設計）人: 謝芳;王春來;張艷禾;李建軍;朱曉凱;李艷玲
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12N15/09;A61K39/02;A61P31/04;C12R1/01
• 代理公司: 北京科龍寰宇知識產權代理有限責任公司 11139
• 代理人: 孫皓晨

技術領域

本發明涉及一種不含抗性標記的豬胸膜肺炎放線桿菌ClpP蛋白酶和ApxIIC雙基因缺失株、其構建方法及應用，屬于細菌基因工程技術領域。

背景技術

豬傳染性胸膜肺炎(porcine?contagious?pleuropneumonia，PCP)是由胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacillus?pleuropneumoniae，APP)引起的一種高度傳染性、致死性的呼吸系統傳染病。目前該病已在世界各國廣泛流行，造成巨大的經濟損失，成為國際公認的危害現代化養豬業的重要傳染病之一。隨著我國現代養殖業規?；?、集約化的發展，本病的發生呈爆發趨勢，有的豬場的陽性率已達到70％以上，嚴重阻礙了我國養豬業的健康發展。

根據APP表面莢膜(CPS)和脂多糖(LPS)抗原性的不同，可將APP分為15個血清型，血清1型又分為1a和1b兩個亞型，血清5型又分為5a和5b兩個亞型。目前在我國已發現并分離到血清型1、2、3、4、5、7、8和15等多種血清型，主要流行的血清型為1、3、5和7型。

溶血素是APP最主要的毒力因子，也是最主要的保護性抗原。目前在APP所有的15個血清型中共發現了4種Apx毒素，分別為Apx?I、Apx?II、Apx?III和ApxIV。APP不同的血清型產生不同的Apx毒素，其中血清7型含有Apx?II和ApxIV。

Apx毒素操縱子的典型結構含有完整的CABD基因；其中，A基因編碼Apx毒素結構蛋白，開始合成時沒有毒素活性，C基因編碼Apx毒素激活蛋白，負責對結構蛋白進行乙酰化激活，形成ApxC-ApxA復合體，毒素活性隨之產生。B基因和D基因的編碼蛋白形成跨膜通道，負責Apx毒素的轉運和分泌。Apx?I和Apx?III操縱子有完整的CABD基因，而Apx?II操縱子缺少B基因和D基因，其產物由Apx?I的BD基因編碼產物負責轉運分泌到細胞外。

生物被膜(Biofilm)是在生物體內和非生物體表面集聚生長的由細菌及其產生的多糖蛋白復合物所形成的固定細菌群落，它是病原菌持續感染、產生耐藥性和免疫逃逸的重要原因之一。APP長期潛伏于豬體內常常引起持續性感染，近年來獲得的許多臨床分離株具有多重耐藥性，并且較普遍地能形成生物被膜，被認為在APP致病過程中發揮重要作用。

生物被膜的產生是一個高度復雜的、由多種基因調控的動態過程，這些基因涉及到細菌的黏附、新陳代謝、群體感應(quorum?sensing)和應激反應(stress?response)等。近年來對病原菌應激反應與感染性疾病的研究發現，ClpP蛋白酶這一應激蛋白是一種十分重要的毒力因子，它是ATP依賴的絲氨酸蛋白酶，調節著細菌對環境各種壓力的適應(如熱休克、營養缺陷、氧化應激等)，維持細菌的形態和毒力，使其在各種環境下得到保護。研究發現該基因的插入突變或缺失通常會降低細菌對不良因素的承受能力，菌體生長被破壞，存活力下降，并影響生物被膜形成，造成毒力減弱。目前雖然僅探索了少數病原菌ClpP蛋白酶的功能，但在揭示致病機理和疫苗研究中已經顯示出極為重要的研究價值和疫苗應用前景。

目前應用的全菌滅活疫苗和亞單位疫苗能夠減輕同源血清型感染豬引起的臨床癥狀并降低死亡率，但不能阻止肺部病變和慢性感染，對異源血清型的感染也不能提供很好的交叉保護，而自然感染或試驗感染能夠誘導對任何異源血清型的保護。因此，高效的弱毒疫苗的研制開發也許是解決當前胸膜肺炎疫苗的不足的一種可行方法。

鑒于上述背景，構建在我國流行的APP血清7型ClpP蛋白酶和Apx?II?C雙基因缺失株，研究其遺傳特性、生長特性、毒力、對動物的致病性和免疫原性等生物學特性，為豬傳染性胸膜肺炎的防治、其它呼吸道傳染病的藥物研究以及疫苗研究奠定重要的基礎。

發明內容

本發明的目的之一在于獲得一種不含抗性標記的豬胸膜肺炎放線桿菌血清7型clpP和apx?IIC雙基因缺失株。

本發明提供的一種不含抗性標記的豬胸膜肺炎放線桿菌血清7型clpP和apx?II?C雙基因缺失株，是將豬胸膜肺炎放線桿菌的ClpP蛋白酶和溶血素激活因子Apx?II?C的編碼基因滅活后得到的缺失株。