[發(fā)明專利]一種不含抗性標(biāo)記的豬胸膜肺炎放線桿菌雙基因缺失株、其構(gòu)建方法及應(yīng)用

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110420236.7
• 申請(qǐng)日: 2011-12-15
• 公開（公告）號(hào): CN102517232A
• 公開（公告）日: 2012-06-27
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 謝芳;王春來(lái);張艷禾;李建軍;朱曉凱;李艷玲
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所
• 主分類號(hào): C12N1/20
• 分類號(hào): C12N1/20;C12N15/09;A61K39/02;A61P31/04;C12R1/01
• 代理公司: 北京科龍寰宇知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限責(zé)任公司 11139
• 代理人: 孫皓晨

1.一種不含抗性標(biāo)記的豬胸膜肺炎放線桿菌雙基因缺失株，其特征在于：該菌株缺失了ClpP蛋白酶和Apx?II?C蛋白的編碼基因。

2.如權(quán)利要求1所述的豬胸膜肺炎放線桿菌雙基因缺失株，其特征在于：所述ClpP蛋白酶的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.2所示，Apx?II?C蛋白的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.4所示。

3.一種構(gòu)建權(quán)利要求1所述的豬胸膜肺炎放線桿菌雙基因缺失株的方法，其特征在于缺失株是通過將DNA片段ΔclpP以及Δapx?II?C導(dǎo)入所述豬胸膜肺炎放線桿菌血清7型菌株經(jīng)同源重組后實(shí)現(xiàn)的；

所述DNA片段ΔclpP從上游至下游依次為上同源臂ClpPS和下同源臂ClpPX：所述上同源臂ClpPS和下同源臂ClpPX能與所述豬胸膜肺炎放線桿菌中的ClpP蛋白酶編碼基因的上游序列和下游序列發(fā)生同源重組，滅活所述ClpP蛋白酶的編碼基因，得到clpP單基因缺失株APPΔclpP；

所述DNA片段Δapx?II?C從上游至下游依次為上同源臂apx?II?CS和下同源臂apx?II?CX，所述上同源臂apx?II?CS和下同源臂apx?II?CX能與所述豬胸膜肺炎放線桿菌中的Apx?II?C蛋白編碼基因的上游序列和下游序列發(fā)生同源重組、滅活所述Apx?II?C蛋白的編碼基因，得到clpP和apx?II?C雙基因缺失株APPΔclpPΔapx?II?C。

4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述ClpP蛋白酶的編碼基因如SEQID?NO.1所示，所述的Apx?II?C蛋白的編碼基因如SEQ?ID?NO.3所示。

5.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于擴(kuò)增上同源臂ClpPS的引物序列如下所示：

clpSF：5’-CG(EcoR?I)GGGGCGTTACTGGATGC-3’

clpSR：5’-CCATCGCTTCGGTTTGC-3’

擴(kuò)增下同源臂ClpPX的引物序列如下：

clpXF：5’-TCCAAAGGCGAATACGGTC-3’

clpXR：5’-CG(BamH?I)TTCTCTGCTTTAAGTGTCGGC-3’

擴(kuò)增上同源臂apx?II?CS的引物序列如下：

II?CSF：5’-CG(EcoR?I)ATGACAACACCAATGATTGATTTAC-3’

II?CSR：5’-AATCCCCGAACTCCCATTC-3’

擴(kuò)增下同源臂apx?II?CX的引物序列如下：

II?CXF：5’-GGATGATGCTCATCTCTATTG-3’

II?CXR：5’-CG(BamH?I)GTTGTAATAAGTCCCGTAACACCAG-3’

所述豬胸膜肺炎放線桿菌血清7型菌株為APP血清7型CVCC265株。

6.如權(quán)利要求1所述的豬胸膜肺炎放線桿菌雙基因缺失株，其特征在于所述的基因缺失株為APPΔclpPΔapx?II?C，保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，其保藏號(hào)為CGMCC?No.5444。

7.權(quán)利要求1、2或6中任一項(xiàng)所述的豬胸膜肺炎放線桿菌雙基因缺失株在制備預(yù)防豬傳染性胸膜肺炎疫苗中的應(yīng)用。

8.一種豬傳染性胸膜肺炎疫苗，其活性成分為權(quán)利要求1、2或6中任一項(xiàng)所述的豬胸膜肺炎放線桿菌雙基因缺失株。