[發明專利]一種不含抗性標記的豬胸膜肺炎放線桿菌雙基因缺失株、其構建方法及應用

無效

• 申請號: 201110420236.7
• 申請日: 2011-12-15
• 公開（公告）號: CN102517232A
• 公開（公告）日: 2012-06-27
• 發明（設計）人: 謝芳;王春來;張艷禾;李建軍;朱曉凱;李艷玲
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12N15/09;A61K39/02;A61P31/04;C12R1/01
• 代理公司: 北京科龍寰宇知識產權代理有限責任公司 11139
• 代理人: 孫皓晨

1.一種不含抗性標記的豬胸膜肺炎放線桿菌雙基因缺失株，其特征在于：該菌株缺失了ClpP蛋白酶和Apx?II?C蛋白的編碼基因。

2.如權利要求1所述的豬胸膜肺炎放線桿菌雙基因缺失株，其特征在于：所述ClpP蛋白酶的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.2所示，Apx?II?C蛋白的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.4所示。

3.一種構建權利要求1所述的豬胸膜肺炎放線桿菌雙基因缺失株的方法，其特征在于缺失株是通過將DNA片段ΔclpP以及Δapx?II?C導入所述豬胸膜肺炎放線桿菌血清7型菌株經同源重組后實現的；

所述DNA片段ΔclpP從上游至下游依次為上同源臂ClpPS和下同源臂ClpPX：所述上同源臂ClpPS和下同源臂ClpPX能與所述豬胸膜肺炎放線桿菌中的ClpP蛋白酶編碼基因的上游序列和下游序列發生同源重組，滅活所述ClpP蛋白酶的編碼基因，得到clpP單基因缺失株APPΔclpP；

所述DNA片段Δapx?II?C從上游至下游依次為上同源臂apx?II?CS和下同源臂apx?II?CX，所述上同源臂apx?II?CS和下同源臂apx?II?CX能與所述豬胸膜肺炎放線桿菌中的Apx?II?C蛋白編碼基因的上游序列和下游序列發生同源重組、滅活所述Apx?II?C蛋白的編碼基因，得到clpP和apx?II?C雙基因缺失株APPΔclpPΔapx?II?C。

4.如權利要求3所述的方法，其特征在于所述ClpP蛋白酶的編碼基因如SEQID?NO.1所示，所述的Apx?II?C蛋白的編碼基因如SEQ?ID?NO.3所示。

5.如權利要求3所述的方法，其特征在于擴增上同源臂ClpPS的引物序列如下所示：

clpSF：5’-CG(EcoR?I)GGGGCGTTACTGGATGC-3’

clpSR：5’-CCATCGCTTCGGTTTGC-3’

擴增下同源臂ClpPX的引物序列如下：

clpXF：5’-TCCAAAGGCGAATACGGTC-3’

clpXR：5’-CG(BamH?I)TTCTCTGCTTTAAGTGTCGGC-3’

擴增上同源臂apx?II?CS的引物序列如下：

II?CSF：5’-CG(EcoR?I)ATGACAACACCAATGATTGATTTAC-3’

II?CSR：5’-AATCCCCGAACTCCCATTC-3’

擴增下同源臂apx?II?CX的引物序列如下：

II?CXF：5’-GGATGATGCTCATCTCTATTG-3’

II?CXR：5’-CG(BamH?I)GTTGTAATAAGTCCCGTAACACCAG-3’

所述豬胸膜肺炎放線桿菌血清7型菌株為APP血清7型CVCC265株。

6.如權利要求1所述的豬胸膜肺炎放線桿菌雙基因缺失株，其特征在于所述的基因缺失株為APPΔclpPΔapx?II?C，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其保藏號為CGMCC?No.5444。

7.權利要求1、2或6中任一項所述的豬胸膜肺炎放線桿菌雙基因缺失株在制備預防豬傳染性胸膜肺炎疫苗中的應用。

8.一種豬傳染性胸膜肺炎疫苗，其活性成分為權利要求1、2或6中任一項所述的豬胸膜肺炎放線桿菌雙基因缺失株。