[發明專利]對高等植物復雜基因組基因進行富集建庫和SNP分析的方法

有效

• 申請號: 201110420042.7
• 申請日: 2011-12-15
• 公開（公告）號: CN103160937A
• 公開（公告）日: 2013-06-19
• 發明（設計）人: 郭鈺;邵迪;韓長磊;陶曄;楊煥明;張秀清
• 申請（專利權）人: 深圳華大基因科技有限公司;深圳華大基因研究院
• 主分類號: C40B50/06
• 分類號: C40B50/06;C40B40/06;C12N15/10;C12Q1/68
• 代理公司: 北京北翔知識產權代理有限公司 11285
• 代理人: 張廣育;姜建成

技術領域

本發明屬于分子生物學領域，尤其涉及一種建立高等植物復雜基因組基因文庫的方法。

背景技術

限制性酶切位點關聯DNA(restriction-site?associated?DNA，RAD)標記技術是指一種將基因組DNA用限制性內切酶消化后，對酶切位點區域進行序列分析的技術。RAD標記應用初期是使用基因芯片技術來對RAD標記進行分離。例如，Lewis等(2007)使用NotI對粗糙鏈孢菌DNA進行了酶切，之后用基因芯片對NotI酶切位點區域進行了序列分析，并完成了對突變位點的作圖；Miller等(2007)用基因芯片技術分析了斑馬魚基因組的EcoRI標記，也完成了對突變位點的作圖；Miller等(2007)測試了使用RAD基因芯片對生物單體以及分離群體進行基因分型，結果顯示，在模式生物與非模式生物中，RAD標記都能很好的進行分型。雖然基因芯片技術能夠高密度的尋找生物體基因組中的RAD標記，但是由于其價格昂貴，限制了應用芯片技術的RAD標記的應用。

近幾年來，由于第二代測序技術的逐漸普及以及相比于芯片技術的價格低廉，發展了使用第二代測序技術對RAD標記進行分析的方法。例如，Baird等(2008)開發了一套利用Illumina測序技術對RAD標記附近區域進行測序的建庫方法，該方法在尋找SNP與RAD標記作圖方面取得了很好的效果。Hohenlohe等(2010)應用第二代測序技術對RAD標記區域進行測序，在5個三刺魚群體共100個個體中找到了45000個SNP位點。Chutimanitsakun等(2011)以大麥為模式生物，評測了RAD測序技術在QTL方面的應用。Pfender等(2011)使用RAD測序技術構建的連鎖圖能夠快速分辨出黑麥草莖的抗銹病基因的QTL位點。截至目前，RAD技術已經在制作遺傳連鎖圖、基因分型、QTL定位等方面得到了越來越廣泛地應用，特別是在無參考序列的情況下尋找酶切位點附近區域SNP時展現出獨特優勢。目前，RAD測序技術在建立文庫時使用的主要是NotI、EcoRI以及SbfI等酶。

已報道的RAD測序技術的研究對象大多數都是基因組構成較為簡單的生物。某些高等開花植物含有復雜的基因組，例如玉米基因組中80％以上是重復序列(Schnable等，2009)。重復序列區的大多數CG序列的胞嘧啶出現甲基化現象(Methylation)，表示為5mC。而在基因區中的CG序列的胞嘧啶很少發生甲基化(Gruenbaum等，1981；Vanyushin等，2011)。在研究這些復雜基因組時，常規的RAD建庫方法得到的基因組文庫中含有大量的重復序列，不能起到富集基因組基因區的作用。

雖然現有技術中已經有對高等植物基因組基因區富集的方法，例如過濾掉甲基化序列的MF(Methylated?Filtration)(Palmer等，2003)、過濾掉高拷貝序列的HC(High-Cot)(Yuan等，2003)、亞甲基部分限制HMPR(Hypomethylated?Partial?Restriction)等，但是Emberton等(2005)的結果表明，上述三種方法構建的文庫基因序列分別僅可以達到總序列的33.8％、23.4％、25.8％。本領域仍然需要一種適用于具有復雜基因組的高等植物的基因區建庫方法。

發明內容

鑒于在研究某些含有復雜基因組的高等開花植物時，常規的RAD建庫方法得到的基因組文庫中含有大量重復序列，給后續的信息分析造成干擾的事實，本發明提供了一種新的建庫方法。在本發明的方法中，使用甲基化敏感酶替代常規的非甲基化敏感酶對基因組進行酶切，之后進行建庫。

在一方面中，本發明提供了一種適合含有復雜基因組的高等開花植物的建庫方法，包括如下步驟：

1)用甲基化敏感酶對從一個或多個樣本提取的基因組DNA進行酶切，獲得DNA片段；

2)對所述DNA片段進行第一接頭連接，獲得具有第一接頭的連接產物，其中在多個樣本基因組DNA的情況下，每種樣品的DNA片段連接的第一接頭帶有不同標簽序列，并將連接第一接頭后的連接產物混合；

3)對所述具有第一接頭連接產物進行打斷及片段回收，獲得回收產物；

4)對所述回收產物進行末端修復，獲得經過末端修復的DNA片段；

5)對所述經過末端修復的DNA片段的3′端加堿基A，獲得具有粘性末端A的DNA片段；

6)對所述具有粘性末端A的片段進行第二接頭連接，獲得具有第二接頭的連接產物；