[發明專利]對高等植物復雜基因組基因進行富集建庫和SNP分析的方法

有效

• 申請號: 201110420042.7
• 申請日: 2011-12-15
• 公開（公告）號: CN103160937A
• 公開（公告）日: 2013-06-19
• 發明（設計）人: 郭鈺;邵迪;韓長磊;陶曄;楊煥明;張秀清
• 申請（專利權）人: 深圳華大基因科技有限公司;深圳華大基因研究院
• 主分類號: C40B50/06
• 分類號: C40B50/06;C40B40/06;C12N15/10;C12Q1/68
• 代理公司: 北京北翔知識產權代理有限公司 11285
• 代理人: 張廣育;姜建成

1.一種構建基因組富集基因區測序文庫的方法，包括如下步驟：

1)用甲基化敏感酶對從一個或多個樣本提取的基因組DNA進行酶切，獲得DNA片段；

2)對所述DNA片段進行第一接頭連接，獲得具有第一接頭的連接產物，其中在多個樣本基因組DNA的情況下，每種樣品的DNA片段連接的第一接頭帶有不同標簽序列，并將連接第一接頭后的連接產物混合；

3)對所述具有第一接頭連接產物進行打斷及片段回收，獲得回收產物；

4)對所述回收產物進行末端修復，獲得經過末端修復的DNA片段；

5)對所述經過末端修復的DNA片段的3′端加堿基A，獲得具有粘性末端A的DNA片段；

6)對所述具有粘性末端A的片段進行第二接頭連接，獲得具有第二接頭的連接產物；

7)對所述具有第二接頭連接產物進行PCR擴增，獲得擴增產物，所述擴增產物構成所述基因組富集基因區測序文庫；

其中，

任選地，步驟1)中的甲基化敏感酶為HpaII、AclI和HpvCH4IV的至少一種；

任選地，步驟1)中的樣本來源于高等植物，優選所述樣本來源于基因組中含重復序列大于等于80％的高等植物。

2.權利要求1的方法，其中步驟1)中提取的基因組DNA量大于等于1.0μg，優選所述基因組DNA量大于等于1.5μg。

3.權利要求1或2的方法，其中步驟2)中的第一接頭是雙鏈結構，所述雙鏈序列為SEQ?ID?NO.1和SEQ?ID?NO.2。

4.權利要求1或2的方法，其中步驟2)中的標簽序列長度為2-10nt。

5.權利要求1或2的方法，其中步驟3)中回收片段的大小為300-700bp；

任選地，所述回收片段的大小為300-500bp；

任選地，所述回收的片段大小為500-700bp。

6.權利要求1或2的方法，其中步驟6)中的第二接頭是雙鏈結構，所述雙鏈序列為SEQ?ID?NO.3和SEQ?ID?NO.4。

7.權利要求1或2的方法，其中步驟7)中的酶切時間為1.0-2.0小時，優選為1.5小時。

8.權利要求1或2的方法，其中步驟7)中的PCR擴增的引物依照所述第一接頭和/或第二接頭設計，例如所述引物序列為SEQ?ID?NO.5和/或SEQ?ID?NO.6。

9.一種對基因組富集基因區進行SNP檢測的方法，包括如下步驟：

1)對根據權利要求1-8任一項所述的方法構建的基因組富集基因區測序文庫進行測序，獲得測序序列；

2)將所述測序序列與參考序列做比對分析，尋找SNP；

其中，

任選地，步驟1)中測序選自在illumina?solexa、ABI?SOLiD和Roche?454中的任一測序平臺上進行；

任選地，步驟2)中的參考序列為同物種的參考基因組或同物種測序所得的讀段。