[發明專利]一種用于啟動子分析的慢病毒T載體及其構建方法和應用

有效

• 申請號: 201110419778.2
• 申請日: 2011-12-15
• 公開（公告）號: CN102517386A
• 公開（公告）日: 2012-06-27
• 發明（設計）人: 潘建治;于福先;朱志偉;陳曉宇;黃菁
• 申請（專利權）人: 浙江省農業科學院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/867;C12N15/66
• 代理公司: 杭州浙科專利事務所 33213
• 代理人: 吳秉中

技術領域

本發明屬于基因工程技術領域，具體涉及一種可用于真核生物啟動子活性分析的慢病毒T載體及其構建方法和應用。

背景技術

基因的表達調控首先由轉錄因子結合到基因的啟動子區從而起始轉錄，許多疾病都與啟動子的活性相關，如遺傳性地中海貧血病和（M.?De?Gobbi等，Science?2006，312：1215-1217）亨丁頓舞蹈癥等（K.?Tanaka等，J?Biol?Chem，2004，279：7275-7286）。因此，在體內和體外進行啟動子的活性分析對于深入探索基因的表達調控及其功能具有重要的意義。啟動子的活性研究，目前，常用的方法是將PCR等獲得的基因啟動子區通過一系列的亞克隆等插入表達載體pGL4.0?或?pEGFP-1中，通過測定熒光素酶的活性或綠色熒光蛋白的表達在體外檢測啟動子的活性或在體內檢測啟動子的活性及組織特異性。

慢病毒廣泛應用于基因治療，細胞功能研究及轉基因動物的制備研究，且被認為是制備轉基因動物最為有效的一種工具（Robl?JM等,?Theriogenology?2007,?67(1):127-133.）。通過制備含有綠色熒光蛋白及特異性啟動子的慢病毒載體，包裝慢病毒制備轉基因動物，可在體內進行啟動子的活性和組織特異性分析。

因此，如果較為全面的完成啟動子的活性分析，需經過構建含有熒光素酶報告基因（Luc2）的載體和構建慢病毒載體制備轉基因動物來完成體外和體內啟動子的活性分析。

發明內容

針對現有技術存在的問題，本發明的目的在于設計提供一種可用于啟動子分析用的慢病毒T載體及其構建方法的技術方案，該載體可直接通過TA克隆策略將基因5’調控區PCR擴增產物連接入載體中，進行啟動子的活性分析，具有操作簡單、制備成本低等特點。

所述的一種用于啟動子分析的慢病毒T載體，其特征在于該T載體基于慢病毒穿梭載體設計而成，將熒光素酶報告基因與綠色熒光蛋白報告基因通過內部核糖體進入位點相連接，可在同一順反子中，表達兩種不同的報告基因。

所述的一種用于啟動子分析的慢病毒T載體，其特征在于所述的慢病毒穿梭載體為慢病毒穿梭載體CSⅡ-EF-MCS-IRES2-Venus。

所述的一種用于啟動子分析的慢病毒T載體，其特征在于所述的熒光素酶報告基因插入去除啟動子后載體中的多克隆位點區。

所述的一種用于啟動子分析的慢病毒T載體的構建方法，其特征在于包括以下工藝步驟：

1）慢病毒穿梭載體CSⅡ-EF-MCS-IRES2-Venus中酶切去除EF啟動子；

2）將步驟1）得到的酶切產物轉入感受態細胞中，構建無啟動子載體CSⅡ-MCS-IRES2-Venus；

3）應用PCR從載體pGL4.0中擴增熒光素酶報告基因，并連接入T載體pMD19-T?Simple中，得到質粒pMD19-Luc2?Simple；

4）通過步驟3）得到的質粒pMD19-Luc2?Simple將熒光素酶報告基因克隆至步驟2）得到的載體CSⅡ-MCS-IRES2-Venus的酶切、去磷處理產物中，得到質粒CSⅡ-?MCS-Luc2-IRES2-Venus；

5）質粒CSⅡ-?MCS-Luc2-IRES2-Venus酶切后，加入dTTP和Taq聚合酶反應得到慢病毒T載體pLenti-T。

所述的一種用于啟動子分析的慢病毒T載體的構建方法，其特征在于所述的步驟1）中使用限制性內切酶AgeⅠ去除載體多克隆位點前的EF啟動子。

所述的一種用于啟動子分析的慢病毒T載體的構建方法，其特征在于所述的步驟3）中PCR擴增在基因5’端引物中引入酶切位點NheⅠ、SwaⅠ和BamHⅠ酶切位點，在基因的3’端引物中引入酶切位點BglⅡ。

所述的一種用于啟動子分析的慢病毒T載體的構建方法，其特征在于所述的步驟4）中載體CSⅡ-MCS-IRES2-Venus使用BamHⅠ酶切，載體CSⅡ-MCS-IRES2-Venus使用CIAP試劑進行去磷處理。

所述的一種用于啟動子分析的慢病毒T載體的構建方法，其特征在于所述的步驟5）中質粒CSⅡ-?MCS-Luc2-IRES2-Venus使用SwaⅠ酶切。

所述的一種用于啟動子分析的慢病毒T載體的構建方法，其特征在于所述的步驟5）中質粒CSⅡ-?MCS-Luc2-IRES2-Venus酶切后，加入dTTP和Taq聚合酶在72℃反應?2小時。

所述的一種用于啟動子分析的慢病毒T載體在體內或體外進行真核生物啟動子活性分析的應用。