[發明專利]一種用于啟動子分析的慢病毒T載體及其構建方法和應用

有效

• 申請號: 201110419778.2
• 申請日: 2011-12-15
• 公開（公告）號: CN102517386A
• 公開（公告）日: 2012-06-27
• 發明（設計）人: 潘建治;于福先;朱志偉;陳曉宇;黃菁
• 申請（專利權）人: 浙江省農業科學院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/867;C12N15/66
• 代理公司: 杭州浙科專利事務所 33213
• 代理人: 吳秉中

1.一種用于啟動子分析的慢病毒T載體，其特征在于該T載體基于慢病毒穿梭載體設計而成，將熒光素酶報告基因與綠色熒光蛋白報告基因通過內部核糖體進入位點相連接，可在同一順反子中，表達兩種不同的報告基因。

2.如權利要求1所述的一種用于啟動子分析的慢病毒T載體，其特征在于所述的慢病毒穿梭載體為慢病毒穿梭載體CSⅡ-EF-MCS-IRES2-Venus。

3.如權利要求1所述的一種用于啟動子分析的慢病毒T載體，其特征在于所述的熒光素酶報告基因插入去除啟動子后載體中的多克隆位點區。

4.一種用于啟動子分析的慢病毒T載體的構建方法，其特征在于包括以下工藝步驟：

1）慢病毒穿梭載體CSⅡ-EF-MCS-IRES2-Venus中酶切去除EF啟動子；

2）將步驟1）得到的酶切產物轉入感受態細胞中，構建無啟動子載體CSⅡ-MCS-IRES2-Venus；

3）應用PCR從載體pGL4.0中擴增熒光素酶報告基因，并連接入T載體pMD19-T?Simple中，得到質粒pMD19-Luc2?Simple；

4）通過步驟3）得到的質粒pMD19-Luc2?Simple將熒光素酶報告基因克隆至步驟2）得到的載體CSⅡ-MCS-IRES2-Venus的酶切、去磷處理產物中，得到質粒CSⅡ-?MCS-Luc2-IRES2-Venus；

5）質粒CSⅡ-?MCS-Luc2-IRES2-Venus酶切后，加入dTTP和Taq聚合酶反應得到慢病毒T載體pLenti-T。

5.如權利要求4所述的一種用于啟動子分析的慢病毒T載體的構建方法，其特征在于所述的步驟1）中使用限制性內切酶AgeⅠ去除載體多克隆位點前的EF啟動子。

6.如權利要求4所述的一種用于啟動子分析的慢病毒T載體的構建方法，其特征在于所述的步驟3）中PCR擴增在基因5’端引物中引入酶切位點NheⅠ、SwaⅠ和BamHⅠ酶切位點，在基因的3’端引物中引入酶切位點BglⅡ。

7.如權利要求4所述的一種用于啟動子分析的慢病毒T載體的構建方法，其特征在于所述的步驟4）中載體CSⅡ-MCS-IRES2-Venus使用BamHⅠ酶切，載體CSⅡ-MCS-IRES2-Venus使用CIAP試劑進行去磷處理。

8.如權利要求4所述的一種用于啟動子分析的慢病毒T載體的構建方法，其特征在于所述的步驟5）中質粒CSⅡ-?MCS-Luc2-IRES2-Venus使用SwaⅠ酶切。

9.如權利要求4所述的一種用于啟動子分析的慢病毒T載體的構建方法，其特征在于所述的步驟5）中質粒CSⅡ-?MCS-Luc2-IRES2-Venus酶切后，加入dTTP和Taq聚合酶在72℃反應?2小時。

10.一種用于啟動子分析的慢病毒T載體在體內或體外進行真核生物啟動子活性分析的應用。