[發(fā)明專利]一種分離純化普那霉素的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110419664.8
• 申請日: 2011-12-15
• 公開（公告）號(hào): CN102558302A
• 公開（公告）日: 2012-07-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王云娜
• 申請（專利權(quán)）人: 北京科朗宏達(dá)科技有限責(zé)任公司
• 主分類號(hào): C07K7/06
• 分類號(hào): C07K7/06;C07K5/037;C07K1/34;C07K1/14
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

一、技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及到一種分離純化普那霉素的方法。

二、背景技術(shù)

近年來，臨床上分離的病原菌的種類及藥敏類型均發(fā)生了很大的變化，MRSA、VRE、PPSP等耐藥菌引起的嚴(yán)重感染使可選用藥物相對(duì)減少，故很有必要尋找新的有效的治療藥物。普那霉素又名原始霉素，是由始旋鏈霉菌(Streptomyces?pristinaespiralis)產(chǎn)生的一類能抗多重耐藥菌的鏈陽性菌素類抗生素，其由兩類化學(xué)性質(zhì)不同的物質(zhì)組成，分別是屬于B族鏈陽性菌素的普那霉素I(PIA、PIB、PIC)和屬于A族鏈陽性菌素的普那霉素II(PIIA、PIIB)，二者組合比例大約是30％的普那霉素I和70％的普那霉素II。

1、普那霉素的功能及應(yīng)用

(1)抗菌活性

試驗(yàn)表明普那霉素在體內(nèi)、外對(duì)眾多革蘭氏陽性菌、部分革蘭氏陰性菌及厭氧菌都具有較強(qiáng)的殺菌作用，對(duì)甲氧西林、紅霉素耐藥或敏感的金葡球菌、溶血葡球菌、表葡球菌、肺炎鏈球菌等皆具有很強(qiáng)的抗菌活性。體外試驗(yàn)表明，普那霉素與萬古霉素存在協(xié)同作用，且體內(nèi)試驗(yàn)顯示普那霉素對(duì)紅霉素耐藥或敏感的MRSA的療效同萬古霉素相當(dāng)。此外，普那霉素還可有效預(yù)防紅霉素耐藥或敏感的鏈球菌引起的心膜炎。

另外，普那霉素具有較長的抗生素后效應(yīng)。Videau等通過小鼠的體內(nèi)、體外試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在普那霉素作用之后的15～20h內(nèi)，細(xì)菌的生長繁殖仍表現(xiàn)出明顯的受抑制狀態(tài)。

(2)臨床應(yīng)用

普那霉素對(duì)很多種感染具有較好的療效，如皮膚和軟組織感染、傳染性肺炎、醫(yī)院獲得性肺炎(作為聯(lián)合治療的一部分)、心內(nèi)膜炎、菌血癥及膿毒血癥等。美國FDA專家小組推薦普那霉素用于皮膚及軟組織感染治療、醫(yī)院獲得性肺炎以及萬古霉素耐藥屎腸球菌(VREF)感染的急重癥病人。據(jù)統(tǒng)計(jì)，普那霉素對(duì)于萬古霉素耐藥VRE感染引發(fā)的菌血癥病人的臨床治療有效率達(dá)70％；而對(duì)MRSA引起的皮膚軟組織感染、醫(yī)院獲得性肺炎、菌血癥的臨床有效率約為70％-75％。與萬古霉素相似，普那霉素亦對(duì)嚴(yán)重骨關(guān)節(jié)感染有顯著療效。在以上所有應(yīng)用普那霉素治療的病例中很少出現(xiàn)治療引起的耐藥菌。普那霉素可作為萬古霉素的替代藥物，在治療多重耐藥革蘭氏陽性菌引起的感染中發(fā)揮其應(yīng)有的作用。

2、普那霉素提取技術(shù)研究現(xiàn)狀

自從1964年羅納-普朗克羅瑞公司就普那霉素的傳統(tǒng)發(fā)酵生產(chǎn)方法申請了專利以來，普那霉素的研究開發(fā)工作一直未受到人們足夠的重視。直到20世紀(jì)90年代，由于臨床上MRSA、VRE以及多重耐藥的“超級(jí)細(xì)菌”的出現(xiàn)，甚至連治療多重耐藥菌的最后一道防線-萬古霉素都顯得“捉襟見肘”時(shí)，普那霉素這類鏈陽性菌素類抗生素又開始重新受到人們的關(guān)注。但大部分研究工作集中在與普那霉素生物合成相關(guān)的酶及基因克隆、普那霉素水溶性衍生物的開發(fā)、抗菌活性及臨床應(yīng)用等方面，而在普那霉素發(fā)酵、提取等生產(chǎn)工藝方面的研究則明顯不足。

普那霉素關(guān)于分離純化的研究報(bào)道較少。迄今為止，文獻(xiàn)和專利中已經(jīng)報(bào)道過的分離純化方法主要包括有機(jī)溶劑萃取、雙水相萃取和高速逆流色譜法。羅納-普朗克羅瑞公司的專利最早報(bào)道了采用有機(jī)溶劑從發(fā)酵液中提取普那霉素的方法：發(fā)酵液酸化處理后再經(jīng)過二氯乙烷逆流離心提取、減壓干燥、石油醚沉淀、干燥等純化步驟后得到普那霉素成品，其中普那霉素的含量約為80％左右。Paquet等用“葡聚糖-聚乙二醇(PEG)”雙水相系統(tǒng)從始旋鏈霉菌發(fā)酵液中萃取分離普那霉素，并以PEG與PEG脂肪酸酯混合液替代PEG相，使分離效果得到了顯著提高。Drogue等用“氯仿-乙酸乙酯-甲醇-水”作為溶劑系統(tǒng)，對(duì)普那霉素粗品采用高速逆流色譜法純化條件進(jìn)行了初步的研究。研究表明，以氯仿∶乙酸乙酯∶甲醇∶水＝2∶2∶3∶2(v∶v)作為溶劑系統(tǒng)，PIIA和PIIB組分的分離度能達(dá)到2.21，但該溶劑系統(tǒng)對(duì)PIA和PIIB組分的選擇性較差?？紤]到PI組分的酸堿性質(zhì)，他們又在上述溶劑系統(tǒng)中加入甲酸來調(diào)節(jié)pH值以增強(qiáng)其對(duì)PIA組分的選擇性，研究發(fā)現(xiàn)以氯仿∶乙酸乙酯∶甲醇∶水∶甲酸＝2.4∶1.6∶3∶2∶0.4(v∶v)作為溶劑系統(tǒng)，只需30min即可分離PIA和PIIB組分，且二者的分離度也可接近2。

表1文獻(xiàn)中報(bào)道的普那霉素分離純化方法的優(yōu)缺點(diǎn)比較