[發(fā)明專利]一種通過農(nóng)桿菌浸染幼穗獲得轉(zhuǎn)基因小麥的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110418620.3
• 申請日: 2011-12-15
• 公開（公告）號: CN102559746A
• 公開（公告）日: 2012-07-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 郎明林;王維;楊學(xué)舉;劉桂茹;溫樹敏;張貴友
• 申請（專利權(quán)）人: 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12N15/84
• 分類號: C12N15/84;A01H5/00
• 代理公司: 北京法思騰知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11318
• 代理人: 高宇;楊小蓉

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及植物轉(zhuǎn)基因工程領(lǐng)域，具體地，涉及一種通過農(nóng)桿菌浸染幼穗獲得轉(zhuǎn)基因小麥的方法。

背景技術(shù)

小麥?zhǔn)呛瘫究?Gramineae)小麥屬(Tritucum)一年生或多年生草本植物，是世界上廣泛種植、總產(chǎn)量僅次于玉米的重要糧食作物。目前小麥新品種的培育依然主要靠常規(guī)育種。由于常規(guī)雜交育種周期長、手段單一、種間雜交困難，而且效率較低、預(yù)見性差，致使雜交后代遺傳背景狹窄、選育難度增大，使小麥育種水平難有突破性提高，育種進(jìn)展緩慢。

利用現(xiàn)代基因工程技術(shù)進(jìn)行小麥的品種改良是當(dāng)前小麥育種的一個(gè)新方向。其主要手段是指利用生物及物理化學(xué)等手段，將外源基因?qū)胫参锛?xì)胞以獲得轉(zhuǎn)基因植物的植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)。自1983年Zambryski獲得世界上第一株轉(zhuǎn)基因植株以來，植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)迅猛發(fā)展，這也使得轉(zhuǎn)基因工程技術(shù)育種成為了可能。它可以打破生殖隔離，使得不同物種間遺傳交流成為可能，為拓寬植物可利用基因庫創(chuàng)造了條件，彌補(bǔ)了常規(guī)雜交育種的不足，加速了作物遺傳育種的發(fā)展。

目前，幾乎所有的作物都開展了轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究，已發(fā)展的方法有以原生質(zhì)體為受體的PEG法和電激法、離子束介導(dǎo)法、花粉管通道法、基因槍法及農(nóng)桿菌介導(dǎo)法等。其中，以農(nóng)桿菌作為媒介的方法由于其簡單易行，不需昂貴的設(shè)備，成本低，轉(zhuǎn)化頻率高，拷貝數(shù)少，遺傳表達(dá)穩(wěn)定性較好等優(yōu)點(diǎn)，越來越受到科研工作者的青睞。雙子葉植物是農(nóng)桿菌的天然寄主，利用農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒介導(dǎo)已經(jīng)將一些外源基因轉(zhuǎn)入雙子葉植物，并建立了多種雙子葉植物的基因轉(zhuǎn)移體系。但由于單子葉植物不是農(nóng)桿菌的天然寄主，加之單子葉植物的外植體再生能力低下、感受態(tài)細(xì)胞缺乏和遺傳轉(zhuǎn)化不穩(wěn)定等，限制了這一方法在禾本科作物上的應(yīng)用。近年來對小麥轉(zhuǎn)基因的研究發(fā)展很快，也取得了一定的成就，但是與水稻、玉米等禾谷類作物以及雙子葉植物相比，仍然存在較大的差距。小麥與其他作物相比進(jìn)行轉(zhuǎn)基因育種的特殊難點(diǎn)主要表現(xiàn)在缺乏一種高效的基因?qū)敕椒āＦ浯?，原生質(zhì)體培養(yǎng)和植株再生只限于個(gè)別基因型，且再生植株的遺傳穩(wěn)定性尚不清楚。而且小麥本身是異源六倍體，其基因組較大并且復(fù)雜，導(dǎo)入外源基因沉默與修飾現(xiàn)象嚴(yán)重。

幼穗作為小麥遺傳轉(zhuǎn)化中優(yōu)良的外植體材料，其愈傷組織誘導(dǎo)率和誘導(dǎo)質(zhì)量均優(yōu)于幼胚。然而，幼穗的遺傳轉(zhuǎn)化也需經(jīng)過組織培養(yǎng)，這就不可避免地要經(jīng)過由于單一的轉(zhuǎn)化細(xì)胞而進(jìn)行組織培養(yǎng)獲得再生植株的過程。為了避免此過程，將此法結(jié)合活體轉(zhuǎn)化便應(yīng)運(yùn)而生。

農(nóng)桿菌介導(dǎo)的浸染幼穗轉(zhuǎn)化方法是近年發(fā)展起來的一種簡便、快速、高效、重復(fù)性好、穩(wěn)定性高的非組織培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因方法。其最大的優(yōu)點(diǎn)在于能直接獲得轉(zhuǎn)化的種子，避開了組織培養(yǎng)和繼代培養(yǎng)，排除了組織培養(yǎng)中因體細(xì)胞變異給目的基因的正確表達(dá)及分子遺傳學(xué)研究帶來的極為不利的遺傳背景，同時(shí)為一些不易建立遺傳再生體系的作物類型提供了基因轉(zhuǎn)移的新途徑。

何道一等(2003)將農(nóng)桿菌滴入小麥小花中進(jìn)行轉(zhuǎn)化，通過PCR和Southern雜交進(jìn)行分子水平鑒定，最終獲得轉(zhuǎn)化植株效率為2.0％～3.2％。Zale等(2009)用農(nóng)桿菌浸泡幼穗的方法成功轉(zhuǎn)化了北美硬紅春小麥Crocus，并能穩(wěn)定表達(dá)外源基因。轉(zhuǎn)化效率為0.44％～6.8％。然而葉興國等(2011)參考Zale等(2009)的方法對我國北方冬麥區(qū)輪選987、科農(nóng)199等多個(gè)當(dāng)前主導(dǎo)冬小麥品種進(jìn)行農(nóng)桿菌侵染轉(zhuǎn)化均未獲得轉(zhuǎn)化籽?；蛑仓?，說明Zale等(2009)的方法可能并不適合對我國當(dāng)前主導(dǎo)冬小麥品種的遺傳轉(zhuǎn)化，需要依據(jù)我國小麥的特性進(jìn)行技術(shù)改良。而且，目前利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的幼穗法獲得轉(zhuǎn)基因小麥的轉(zhuǎn)化效率也并不理想，并且所用品種主要是春小麥。因此，迫切需要針對我國當(dāng)前主導(dǎo)小麥品種的一種穩(wěn)定、高效、簡便的獲得轉(zhuǎn)基因小麥的方法

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種通過農(nóng)桿菌浸染幼穗獲得轉(zhuǎn)基因小麥的方法。

根據(jù)本發(fā)明的通過農(nóng)桿菌浸染幼穗獲得轉(zhuǎn)基因小麥的方法，包括以下步驟：

1)培養(yǎng)包含載有目的基因的表達(dá)載體的農(nóng)桿菌菌株，用浸染培養(yǎng)基懸浮菌體，

其中，用YEB培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)到OD₆₀₀為1.5～2.0，離心，沉淀菌體后用浸染培養(yǎng)基懸浮菌體至OD₆₀₀＝0.6～0.8，所述YEB培養(yǎng)基為，酵母提取物1g/L，牛肉膏5g/L，胰蛋白胨5g/L，蔗糖5g/L，MgSO4·7H₂O?0.5g/L，pH7.0；