[發明專利]30種氨基酸同時定量檢測方法及試劑盒制備

無效

• 申請號: 201110417088.3
• 申請日: 2011-12-14
• 公開（公告）號: CN103163226A
• 公開（公告）日: 2013-06-19
• 發明（設計）人: 劉麗宏;李鵬飛;李丹;張緒得;陶蓓蓓
• 申請（專利權）人: 劉麗宏;李鵬飛;李丹
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N27/62
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

所屬技術領域

本發明涉及一種基于液相色譜-串聯質譜技術(LC-MS/MS)開發的30種氨基酸同時定量檢測試劑盒，更具體地說是采用液相色譜-串聯質譜技術對樣本中30種氨基酸進行高靈敏度定量檢測的方法。

本發明還涉及本發明試劑盒的生產方法和應用。

背景技術

氨基酸(Amino?acid)是含有氨基和羧基的一類有機化合物的通稱。自然界中已發現的氨基酸有180多種，人體內重要的氨基酸有30多種。生命的產生、存在和消亡，無一不與蛋白質有關，而氨基酸正是蛋白質的基本單位，所以如果人體氨基酸發生變化，不在正常值范圍內，就會導致生理功能異常，影響機體代謝的正常進行，最后導致疾病。目前氨基酸代謝障礙所引起的疾病已超過400多種，涉及代謝、腫瘤、免疫、心腦血管、神經系統、腎病、糖尿病、亞健康、老年病等各類疾病和人體生長發育、營養健康、肌肉骨骼生長、激素分泌、解毒功能等各個健康環節。

氨基酸在醫藥上也有廣泛應用。目前用作藥物的氨基酸有一百幾十種，其中包括構成蛋白質的氨基酸有20種和構成非蛋白質的氨基酸有100多種。因此，檢測復雜樣本中氨基酸的含量對臨床檢驗、工業生產和科學研究等都具有重要意義。

1958年Spackman等首先提出了用陽離子交換色譜與柱后茚三酮衍生結合的方法分析蛋白質中的氨基酸，實現了氨基酸分析的自動化。其后，新的氨基酸分析方法不斷涌現，柱前衍生反相高效液相色譜法、高效陰離子交換色譜-積分脈沖安培檢測法、毛細管電泳法、液相色譜法等相繼應用于氨基酸分析。傳統的氨基酸分析技術已很難滿足極微量氨基酸的準確和高通量檢測需求。

液相色譜-串聯質譜技術以液相色譜作為分離系統，質譜作為檢測系統，樣本在液相色譜質譜部分分別被分離及離子化，經檢測器得到質譜圖，具有高選擇性、高靈敏度、樣本處理簡單和自動化程度高的特點，日漸成為體內外定性和定量分析的實用方法。研究開發一種結果準確、嚴格區分同分異構體、分析通量高、價格低廉、操作簡便、易于推廣的30種氨基酸LC-MS/MS同時定量檢測試劑盒，使其能廣泛應用于復雜樣本中氨基酸臨床、科研和工業生產，將有助于提高氨基酸檢測質量、促進檢測方法標準化和規范化。

發明內容

本發明的目的在于提供一種高靈敏和高通量的30種氨基酸同時定量檢測試劑盒，以滿足臨床檢驗、工業生產和科學研究等對氨基酸定量檢則的需要。

本發明的另一目的在于提供上述試劑盒的制備方法。

技術方案

本試劑盒是一種采用LC-MS/MS測定復雜樣本中30種氨基酸(精氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、天門冬氨酸、瓜氨酸、谷氨酸、纈氨酸、甘氨酸、酪氨酸、丙氨酸、鳥氨酸、異亮氨酸、賴氨酸、蘇氨酸、色氨酸、組氨酸、γ-氨基丁酸、絲胺酸、牛磺酸、脯氨酸、半胱氨酸、同型半胱氨酸、α-氨基正丁酸、肌氨酸、δ-羥基賴氨酸、羥基脯氨酸、1-甲基組氨酸、3-甲基組氨酸、焦谷氨酸)濃度的新型試劑盒。復雜樣本中氨基酸經有機溶劑提取處理后采用甲醇沉淀并加入穩定同位素標記的氨基酸內標，用鹽酸正丁醇為衍生化試劑進行處理，吹干復溶后上清液進行LC-MS/MS檢測，記錄氨基酸和內標的峰面積。根據氨基酸對應穩定同位素內標濃度、樣本中的氨基酸/對應同位素內標峰面積比值即可計算出每種氨基酸的濃度。測定結果為復雜樣本中氨基酸濃度。

本發明的試劑盒制備過程包括如下步驟：

1.穩定同位素內標凍干粉：12種穩定同位素標記氨基酸對照品凍干粉(含²H₄；5-¹³C-精氨酸、²H₃-亮氨酸、²H₃-甲硫氨酸、¹³C₆-苯丙氨酸、²H₃-天門冬氨酸、²H₂-瓜氨酸、²H₃-谷氨酸、²H₈-纈氨酸、¹³C₆-酪氨酸、²H₄-丙氨酸、²H₃-鳥氨酸均0.5pmoL；含¹⁵N；2-¹³C-甘氨酸2.5pmoL)，貼簽標記，完成操作。