[發(fā)明專利]一種提取河蟹絨毛DNA的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110413783.2
• 申請(qǐng)日: 2011-12-13
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102424820A
• 公開(kāi)（公告）日: 2012-04-25
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王成輝;周陸;王軍
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 上海海洋大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/10
• 分類號(hào): C12N15/10
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及河蟹絨毛DNA的提取方法，具體地，涉及一種快速、方便、無(wú)損傷生物體的提取高質(zhì)量DNA的方法。

背景技術(shù)

河蟹包括中華絨螯蟹(Eriocheir?sinensis)、日本絨螯蟹(Eriocheir?japonica)和合浦絨螯蟹(Eriocheir?hepuensis)等，它們均隸屬于節(jié)肢動(dòng)物門(mén)(Arthropoda)、甲殼綱(Crustaceae)、十足目(Decapoda)、方蟹科(Grapsidae)，絨螯蟹屬(Eriocheir)。中華絨螯蟹是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)甲殼動(dòng)物和水產(chǎn)養(yǎng)殖對(duì)象，在我國(guó)自然分布廣泛，但主要分布于長(zhǎng)江、遼河以及甌江流域。自20世紀(jì)80年代后期，河蟹的人工養(yǎng)殖和苗種培育迅猛發(fā)展，出現(xiàn)了中華絨鰲蟹盲目的人工移殖，已造成各水系絨鰲蟹種質(zhì)資源混雜和性狀衰退。鑒于此，為保證中華絨螯蟹寶貴物種資源的可持續(xù)利用，必須加強(qiáng)對(duì)其遺傳資源的研究，分析其遺傳多樣性。

然而，進(jìn)行河蟹的遺傳研究以及種質(zhì)資源的提純和復(fù)壯，需要對(duì)大量的河蟹樣本進(jìn)行分子生物學(xué)分析，而進(jìn)行分子生物學(xué)分析工作的基礎(chǔ)是獲得良好的DNA以及RNA等樣本。傳統(tǒng)的河蟹DNA提取往往利用河蟹的肌肉進(jìn)行細(xì)胞裂解消化，然后提取DNA，這種提取DNA的方法對(duì)河蟹具有很嚴(yán)重的損傷，往往會(huì)影響一些優(yōu)質(zhì)河蟹的后期育種工作，由于缺少了部分的步足，會(huì)導(dǎo)致河蟹的抱卵率低、成活率低、甚至死亡的現(xiàn)象，嚴(yán)重制約了河蟹的人工育苗技術(shù)，進(jìn)而影響了河蟹的遺傳改良工作。由此可見(jiàn)，開(kāi)展河蟹無(wú)損傷的DNA提取方法十分重要。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是：通過(guò)設(shè)計(jì)河蟹絨毛細(xì)胞的裂解緩沖液和飽和NaCL法提取河蟹基因組DNA，提供一種簡(jiǎn)便、快速、高效的提取河蟹絨毛DNA的方法，提取河蟹絨毛DNA質(zhì)量高，可用于種質(zhì)研究與遺傳分析，既保障河蟹活體的無(wú)損傷，又滿足了實(shí)驗(yàn)DNA樣本的需求。

本發(fā)明提供的技術(shù)方案是：一種提取河蟹DNA的方法，包括如下步驟：

(1)剪取河蟹絨毛；

(2)提取河蟹絨毛DNA，步驟如下：

a.將第(1)步剪取的河蟹絨毛加裂解緩沖液和蛋白酶K進(jìn)行消化，其中裂解緩沖液的成分與濃度為：0.05M?EDTA，2％SDS，0.01M?Tris-Cl，0.3M乙酸鈉，10mg/ml?DTT；

b.將步驟a得到的消化液離心，取上清液加飽和NaCl溶液和氯仿，混勻；

c.離心，取上清液加入異丙醇；

d.離心沉淀DNA；

e.洗滌DNA，輕搖混勻；

f.離心，將沉淀DNA烘干；

g.在烘干后的DNA加去離子水或TE溶液，并加入RNA酶去除DNA中的RNA，保存?zhèn)溆谩?/p>

所述的提取河蟹絨毛DNA的方法，第(1)步中，剪取河蟹螯足上的絨毛少許，剪取過(guò)程中盡量取靠近基部毛囊部的絨毛。

所述的提取河蟹絨毛DNA的方法，步驟a中，優(yōu)選地，河蟹絨毛的根數(shù)與加裂解緩沖液和蛋白酶K的量之間的關(guān)系是：河蟹絨毛15-20根，加500ml裂解緩沖液和濃度為20mg/ml的蛋白酶K?20μL，于56℃的的烘箱中過(guò)夜消化，至澄清的裂解緩沖液轉(zhuǎn)變?yōu)榛鞚岢食赛S色為止。

本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)：

本發(fā)明方法是本發(fā)明人近幾年在對(duì)中國(guó)各水系河蟹DNA提取的不斷摸索過(guò)程中，選擇河蟹絨毛作為提取DNA的材料，通過(guò)設(shè)計(jì)河蟹絨毛細(xì)胞的裂解緩沖液，利用河蟹鰲足上的絨毛通過(guò)飽和NaCL法提取河蟹基因組DNA可以滿足不傷害河蟹自身，又能獲得良好的DNA的要求，不僅在科學(xué)技術(shù)上，而且在河蟹種質(zhì)資源保護(hù)與利用上均具有十分重要的意義和價(jià)值，而且對(duì)其它甲殼動(dòng)物的DNA提取也具有借鑒作用。

本發(fā)明方法可簡(jiǎn)便、快速、有效的提取河蟹絨毛DNA，提取的DNA質(zhì)量高，不受蛋白質(zhì)的污染，提取的絨毛DNA可用于分子生物學(xué)分析，從而為河蟹的遺傳多樣性研究、種質(zhì)保護(hù)和資源利用提供一項(xiàng)技術(shù)手段，具有重大科學(xué)意義和實(shí)用價(jià)值。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明提取DNA的電泳直接檢測(cè)結(jié)果；

圖2為本發(fā)明提取DNA的微衛(wèi)星引物PCR擴(kuò)增檢測(cè)結(jié)果。

具體實(shí)施方式

一、絨毛采取

1.剪取河蟹螯足(蟹鉗)上的絨毛少許，剪取過(guò)程中盡量取靠近基部毛囊部的絨毛。

2.剪取的絨毛用去離子水清洗兩遍，去除絨毛上的灰土等雜質(zhì)，洗凈后的絨毛用于DNA直接提取，或保存于95％的酒精中備以后提取DNA。

二、絨毛DNA提取