[發(fā)明專利]篩選和/或分析目標(biāo)配體的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110412780.7
• 申請日: 2011-12-12
• 公開（公告）號: CN103163205A
• 公開（公告）日: 2013-06-19
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 水雯箐;饒子和;李偉;郭宇;楊誠
• 申請（專利權(quán)）人: 天津市國際生物醫(yī)藥聯(lián)合研究院;南開大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院
• 主分類號: G01N27/62
• 分類號: G01N27/62
• 代理公司: 北京德恒律師事務(wù)所 11306
• 代理人: 陸鑫;房嶺梅

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種分析方法，具體而言，本發(fā)明涉及一種篩選和/或分析目標(biāo)配體的方法。

背景技術(shù)

高通量篩選(High?throughput?screening，HTS)技術(shù)是指以分子水平和細(xì)胞水平的實(shí)驗(yàn)方法為基礎(chǔ)，以微板形式作為實(shí)驗(yàn)工具載體，以自動化操作系統(tǒng)執(zhí)行試驗(yàn)過程，以靈敏快速的檢測儀器采集實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)，以計(jì)算機(jī)對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，同一時間對數(shù)以千萬樣品檢測，并以相應(yīng)的數(shù)據(jù)庫支持整體系運(yùn)轉(zhuǎn)的技術(shù)體系。

常用的篩選模型都在分子水平和細(xì)胞水平，觀察的是藥物與分子靶點(diǎn)(也稱為靶蛋白)的結(jié)合作用，能夠直接認(rèn)識藥物的基本作用機(jī)制。目前這些模型主要集中在受體、酶、通道以及各種細(xì)胞反應(yīng)方面。近年也出現(xiàn)了基因水平的藥物篩選模型，使藥物篩選模型的范圍更為廣泛。舉例而言，以酶為作用靶的高通量篩選方法，絕大多數(shù)是使用放射性或者比色、熒光的方法來直接檢測酶活性，從而評價各種待測試的化合物分子對酶活性的影響(抑制或增強(qiáng))。多數(shù)情況下，篩選靶標(biāo)酶的小分子抑制劑是為發(fā)現(xiàn)藥物前體分子而廣泛采用的途徑。

但是高通量篩選方法也具有以下缺點(diǎn)：

1)根據(jù)靶蛋白的功能發(fā)展一套特定的HTS方法，往往是費(fèi)時費(fèi)力的過程。通常需要對測定該蛋白的酶活性的常規(guī)生化方法進(jìn)行很多的改變和優(yōu)化才能達(dá)到建立HTS方法的要求。而且，一旦改換待研究的靶蛋白，就需要重新設(shè)計(jì)一套HTS方法。

2)HTS篩選體系會產(chǎn)生一定的假陽性結(jié)果。例如蛋白質(zhì)的非特異性聚合、降解會導(dǎo)致其自身活性的改變，產(chǎn)生假陽性的篩選結(jié)果。有研究報道，常規(guī)HTS技術(shù)所得到的候選分子其中60-80％能夠被其他獨(dú)立的技術(shù)所確認(rèn)，剩余的20-40％的結(jié)果無法被重復(fù)；對于形式較復(fù)雜的HTS篩選體系，只有25％的結(jié)果可以被其他技術(shù)所重現(xiàn)和確認(rèn)。

3)HTS技術(shù)通常篩選的對象是純化的化合物單體。如果帶測試的對象為混合物(例如天然產(chǎn)物粗分得到的不同組分)，則給出的數(shù)據(jù)代表的是多組分共同干擾酶活性的整體結(jié)果，單由這一結(jié)果無法得知是混合物中的何種成分真正起到作用。

蛋白質(zhì)復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)解析是在原子層面上獲得關(guān)于蛋白質(zhì)復(fù)合物的三維結(jié)構(gòu)信息的技術(shù)手段。通常需要得到蛋白質(zhì)復(fù)合物的晶體，而后使用X射線衍射技術(shù)解析其三維結(jié)構(gòu)。一旦該方法成功得應(yīng)用于待研究的靶蛋白和藥物分子，便能夠詳細(xì)得了解藥物分子與靶標(biāo)蛋白結(jié)合作用的分子機(jī)制。

對于待篩選的化合物分子，可將它與靶蛋白的晶體浸泡之后形成共晶(即復(fù)合物的晶體)，而后解析該復(fù)合物的三維結(jié)構(gòu)，準(zhǔn)確得了解配體分子的結(jié)合位點(diǎn)和結(jié)合的空間模式。

但是蛋白質(zhì)復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)解析方法具有以下缺點(diǎn)：

1)整個實(shí)驗(yàn)流程周期長，成本高。對于靶蛋白及其復(fù)合物，摸索合適的結(jié)晶條件往往需要幾個月甚至幾年的努力，消耗大量的人力物力；在許多情況下，無論如何優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件都難以得到需要的蛋白質(zhì)晶體。

2)通常情況下，這一技術(shù)僅用于分析與單一的配體(同靶蛋白結(jié)合的任何分子都稱為配體)有結(jié)合作用的蛋白質(zhì)，要求配體分子達(dá)到很高的純度。因此，對于篩選由天然產(chǎn)物/中藥提取出的組成復(fù)雜的混合物，必須進(jìn)行多步純化得到近乎單一的組分，才能使用該方法逐一得研究特定的小分子化合物和靶蛋白的結(jié)合作用。

因此，需要發(fā)展一種普適性高，能夠排除HTS的假陽性結(jié)果，以及能夠適用于含有多種小分子化合物的混合物(例如天然產(chǎn)物提取物的初級分離產(chǎn)物)的分析配體和靶蛋白之間的結(jié)合作用的方法。

發(fā)明內(nèi)容

為了解決現(xiàn)有問題，本發(fā)明提供了一種普適性高，能夠排除HTS的假陽性結(jié)果，以及能夠適用于含有多種小分子化合物的混合物的分析配體和靶蛋白之間的結(jié)合作用的方法。

根據(jù)本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明提供的分析方法包括以下步驟：

1)對靶蛋白進(jìn)行純化

由于通過生物工程技術(shù)制備的靶蛋白的溶液不適用于直接的質(zhì)譜分析，我們首先需要對該蛋白質(zhì)溶液進(jìn)行緩沖液的置換，去除其中所含的對質(zhì)譜分析有嚴(yán)重干擾性的鹽類小分子。該步驟可以使用離心式濃縮管、微透析或者微型色譜柱來實(shí)現(xiàn)。

優(yōu)選的靶蛋白是特定病毒合成的蛋白酶(例如HIV蛋白酶和SARS冠狀病毒主蛋白酶)或核酸內(nèi)切酶，該蛋白靶標(biāo)對病毒的繁殖和侵襲宿主具有關(guān)鍵作用。

2)利用高通量酶活性測試系統(tǒng)篩選出對靶蛋白的活性具有抑制效果的候選抑制劑