[發明專利]農桿菌介導的尖孢鐮刀菌芝麻專化型菌株遺傳轉化方法

無效

• 申請號: 201110412454.6
• 申請日: 2011-12-12
• 公開（公告）號: CN102492715A
• 公開（公告）日: 2012-06-13
• 發明（設計）人: 苗紅梅;仇存璞;魏利斌;張海洋
• 申請（專利權）人: 河南省農業科學院
• 主分類號: C12N15/80
• 分類號: C12N15/80;C12N1/15;C12R1/77
• 代理公司: 鄭州睿信知識產權代理有限公司 41119
• 代理人: 牛愛周

技術領域

本發明涉及一種農桿菌介導的尖孢鐮刀菌芝麻專化型菌株外源基因轉化的方法，屬于生物技術領域。

背景技術

芝麻枯萎病是芝麻主要病害之一，主要分布在我國北部、中部芝麻栽培區，發并普遍且嚴重。該病由尖孢鐮刀菌芝麻專化型菌株侵染引起，在無寄主的情況下，病原菌厚垣孢子能夠在土壤中存活6年以上，單一采用化學防治、物理防治及生物防治等方法不能對該病進行較好地防控，目前人們對尖孢鐮刀菌芝麻專化型致病機理認識尚不夠深入，研究進展緩慢。在鐮刀菌致病性研究方面，有報道利用遺傳轉化的病原菌成功開展了病原菌致病及侵染機理等相關研究。為獲得帶有GFP等外源標記基因的尖孢鐮刀菌芝麻專化型菌株，構建尖孢鐮刀菌芝麻專化型菌株突變體庫，目前急需探討一種能成功獲得尖孢鐮刀菌芝麻專化型遺傳轉化的方法，以推動我國芝麻枯萎病害研究進展，為今后的病原菌致病相關基因克隆以及病原菌與芝麻互作研究奠定基礎。

發明內容

本發明目的在于提供一種農桿菌介導的尖孢鐮刀菌芝麻專化型病原菌遺傳轉化的方法。

為了實現上述目的，本發明的技術方案采用了一種農桿菌介導的尖孢鐮刀菌芝麻專化型菌株遺傳轉化方法，包括以下步驟：

(1)制備尖孢鐮刀菌芝麻專化型菌株分生孢子懸浮液；

(2)尖孢鐮刀菌芝麻專化型菌株的T-DNA轉化。

步驟(1)方法如下：挑取少量尖孢鐮刀菌菌絲接種于PDA平板上，于24-27℃條件培養5-7d后，加4-6mL無菌水涂布，上面鋪兩層滅菌擦鏡紙，然后將菌液收集到EP管中，用無菌水調節其濃度，制備成孢子懸浮液備用。

步驟(2)的轉化如下：1)從新鮮培養的LB平板上挑選攜帶有表達載體質粒的農桿菌AGL-1單克隆，接種于5mL?LB液體培養基上，200rpm、28℃下過夜培養；2)取200-400μL農桿菌AGL-1培養液，加入到5mL誘導液體培養基(IM)中，28℃振蕩培養5-6個小時，使菌液OD₆₀₀達到0.5-0.6；3)取上述農桿菌AGL-1菌液100μL，與100μL?1×10⁶個/mL的尖孢鐮刀菌分生孢子懸浮液均勻混合，120rpm、22℃振蕩培養24h，然后將上述菌液均勻涂布于IM平板上的硝酸纖維素膜表面，22℃共培養兩天；4)兩天后，用無菌剪刀把硝酸纖維素膜剪成寬0.8cm的小條，放于篩選培養基上在26℃的溫度下培養至轉化子產生；5)用無菌牙簽挑取單個轉化子接種到PDA平板上，26℃培養再次篩選鑒定，保存得到的轉化子，用于陽性檢測。

1)中的液體培養基組成為：50μg·mL^-1抗生素和50μg·mL^-1利福平。

2)中的誘導液體培養基組成為：50μg·mL^-1抗生素和75μmol·L^-1乙酰丁香酮。

所述的抗生素為卡那霉素。

3)中所述的平板中含75μmol·L^-1乙酰丁香酮(AS，acetosyringone)。

4)中的篩選培養基組成為：PDA+100μg·mL^-1抗生素+400μg·mL^-1頭孢氨芐+60μg·mL^-1鏈霉素。

5)中的PDA平板上涂有100μg·mL^-1抗生素。

所述的抗生素優選為潮霉素。

本發明的方法以尖孢鐮刀菌芝麻專化型病菌為轉化體，利用農桿菌介導的方法，結合適宜的遺傳轉化受體系統，將外源T-DNA序列轉入到尖孢鐮刀菌芝麻專化型菌株基因組中，首次獲得了尖孢鐮刀菌芝麻專化型轉基因菌株。該方法重復性好，轉化效率高，可用于今后的尖孢鐮刀菌芝麻專化型突變體庫構建；獲得的菌株含有雙標記基因，可用于芝麻枯萎病害機理分析，是芝麻枯萎病菌致病及芝麻抗病研究中的一個重要創新。該方法利用農桿菌介導途徑，結合適宜的轉化步驟和篩選方法，成功將外源基因序列高效轉入尖孢鐮刀菌芝麻專化型菌株，方法簡單可行，重復性好，轉化效率高。本發明確定了尖孢鐮刀菌芝麻專化型遺傳轉化的高效方法，也為今后探明芝麻枯萎病病菌致病機理及芝麻抗病機理，以及有效防控芝麻枯萎病奠定了基礎。

附圖說明

圖1是鋪有硝酸纖維素薄膜的誘導液體培養基IM平板；

圖2是將硝酸纖維素薄膜剪成條狀轉移到選擇性培養基上；

圖3是尖孢鐮刀菌芝麻專化型轉化子在抗性培養基上的初次篩選結果；