[發明專利]農桿菌介導的尖孢鐮刀菌芝麻專化型菌株遺傳轉化方法

無效

• 申請號: 201110412454.6
• 申請日: 2011-12-12
• 公開（公告）號: CN102492715A
• 公開（公告）日: 2012-06-13
• 發明（設計）人: 苗紅梅;仇存璞;魏利斌;張海洋
• 申請（專利權）人: 河南省農業科學院
• 主分類號: C12N15/80
• 分類號: C12N15/80;C12N1/15;C12R1/77
• 代理公司: 鄭州睿信知識產權代理有限公司 41119
• 代理人: 牛愛周

1.一種農桿菌介導的尖孢鐮刀菌芝麻專化型菌株遺傳轉化方法，其特征在于：包括以下步驟：

(1)制備尖孢鐮刀菌芝麻專化型菌株分生孢子懸浮液；

(2)尖孢鐮刀菌芝麻專化型菌株的T-DNA轉化。

2.根據權利要求1所述的農桿菌介導的尖孢鐮刀菌芝麻專化型菌株遺傳轉化方法，其特征在于：步驟(1)方法如下：挑取少量尖孢鐮刀菌菌絲接種于PDA平板上，于24-27℃條件培養5-7d后，加4-6mL無菌水涂布，上面鋪兩層滅菌擦鏡紙，然后將菌液收集到EP管中，用無菌水調節其濃度，制備成孢子懸浮液備用。

3.根據權利要求1所述的農桿菌介導的尖孢鐮刀菌芝麻專化型菌株遺傳轉化方法，其特征在于：步驟(2)的轉化如下：1)從新鮮培養的LB平板上挑選攜帶有表達載體質粒的農桿菌AGL-1單克隆，接種于5mL?LB液體培養基上，200rpm、28℃下過夜培養；2)取200-400μL農桿菌AGL-1培養液，加入到5mL誘導液體培養基(IM)中，28℃振蕩培養5-6個小時，使菌液OD600達到0.5-0.6；3)取上述農桿菌AGL-1菌液100μL，與100μL?1×10⁶個/mL的尖孢鐮刀菌分生孢子懸浮液均勻混合，120rpm、22℃振蕩培養24h，然后將上述菌液均勻涂布于IM平板上的硝酸纖維素膜表面，22℃共培養兩天；4)兩天后，用無菌剪刀把硝酸纖維素膜剪成寬0.8cm的小條，放于篩選培養基上在26℃的溫度下培養至轉化子產生；5)用無菌牙簽挑取單個轉化子接種到PDA平板上，26℃培養再次篩選鑒定，保存得到的轉化子，用于陽性檢測。

4.根據權利要求3所述的農桿菌介導的尖孢鐮刀菌芝麻專化型菌株遺傳轉化方法，其特征在于：1)中的液體培養基組成為：50μg·mL^-1抗生素和50μg·mL^-1利福平。

5.根據權利要求3所述的農桿菌介導的尖孢鐮刀菌芝麻專化型菌株遺傳轉化方法，其特征在于：2)中的誘導液體培養基組成為：50μg·mL^-1抗生素和75μmol·L^-1乙酰丁香酮。

6.根據權利要求4或5所述的農桿菌介導的尖孢鐮刀菌芝麻專化型菌株遺傳轉化方法，其特征在于：所述的抗生素為卡那霉素。

7.根據權利要求3所述的農桿菌介導的尖孢鐮刀菌芝麻專化型菌株遺傳轉化方法，其特征在于：3)中所述的平板中含75μmol·L^-1乙酰丁香酮(AS，acetosyringone)。

8.根據權利要求3所述的農桿菌介導的尖孢鐮刀菌芝麻專化型菌株遺傳轉化方法，其特征在于：4)中的篩選培養基組成為：PDA+100μg·mL^-1抗生素+400μg·mL^-1頭孢氨芐+60μg·mL^-1鏈霉素。

9.根據權利要求3所述的農桿菌介導的尖孢鐮刀菌芝麻專化型菌株遺傳轉化方法，其特征在于：5)中的PDA平板上涂有100μg·mL-1抗生素。

10.根據權利要求8或9所述的農桿菌介導的尖孢鐮刀菌芝麻專化型菌株遺傳轉化方法，其特征在于：所述的抗生素優選為潮霉素。