[發明專利]一種基于時間分辨熒光免疫分析技術的人血清白蛋白(HSA)定量檢測試劑盒

無效

• 申請號: 201110412039.0
• 申請日: 2011-12-09
• 公開（公告）號: CN103163301A
• 公開（公告）日: 2013-06-19
• 發明（設計）人: 萬勇;吳英松;陳殷;陳少瑯;黃黌;姚小艷
• 申請（專利權）人: 中山大學達安基因股份有限公司
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于生物分析化學、納米生物技術領域，具體地說，涉及一種基于時間分辨熒光免疫分析技術的HSA定量檢測試劑盒，可用于測定疫苗類相關生物制品中所含人血清白蛋白的濃度，輔助生產過程中產品質量的管控。?

背景技術

人血清白蛋白(HSA)是人血漿中的蛋白質，其非糖基化的單鏈多肽包含585個氨基酸，分子量為66kD。在血漿中其濃度為42g/L，約占血漿總蛋白的60％。在體液中人血清白蛋白可以運輸脂肪酸、膽色素、氨基酸、類固醇激素、金屬離子和許多治療分子等，同時還維持血液正常的滲透壓。?

在生物制品尤其是疫苗的生產中，HSA作為一種常用的添加組份，可以有效維持生物制品中活性成分的穩定，這也是《中國藥典》指定被允許加入多種生物制品中的穩定劑之一。然而，如果生物制品中的HSA添加量過高則有可能打破患者體液平衡，引發身體不適或疾病的發生；過低則可能無法維持產品中生物活性組分的穩定。因此，在生物制品的質量管理中，嚴格控制HSA的正確添加量，是影響產品質量的關鍵環節之一。?

目前檢測HSA大多采用酶免疫分析(Enzymatic?immunoassay，EIA)、化學發光免疫分析(Chemilinescent?immunoassay，CLIA)和一些化學反應檢測方法，但酶免分析為定性或半定量試劑，不能準確定量，難以滿足生產實踐需要。化學發光免疫分析試劑與其它標記技術相比有許多優點：①無放射性輻射的危害；②靈敏度高，檢測線性范圍寬；③穩定性好、自動化程度高；④應用范圍寬，可檢測不同分子大小的抗原、半抗原和抗體，又可以用于核酸探針的檢測。但化學發光免疫分析試劑同時也有發光過程短、樣品不能重復檢測、本底較高及易受環境物質干擾，加之成本較高，一定程度上阻礙了其應用的范圍的缺點。化學反應方法雖然有一定的參考性，但其一般用于總蛋白濃度的測定，特異性差，不能在多組分蛋白溶液中測出HSA組份的含量。?

TRFIA技術是繼放射免疫分析之后標記物發展的一個新里程碑，已成為生物醫學研究和臨床生化檢驗中一項最有發展前景的分析手段。TRFIA以稀土離子作為標記物，具有制備簡便、儲存時間長、無放射性污染、標準曲線范圍寬、不受樣品自然熒光干擾和應用范圍十分廣泛等優點，非常適用于定量要求高、重復性好、需批量處理的檢測樣品。?

目前TRFIA技術已廣泛應用于多種臨床檢測項目中，但運用該技術檢測HSA的尚無文獻報道。?

發明內容

本發明的目的在于提供一種人血清白蛋白的時間分辨熒光免疫分析定量檢測方法及試?劑盒。?

本發明檢測方法的原理是雙抗體夾心的免疫反應：將抗HSA的一株單克隆抗體包被到96孔微孔板上，封閉，將HSA校準品及待檢樣品加入反應孔中振蕩反應，再加入另一株銪標記抗HSA單克隆抗體充分反應后洗板。加入增強液震蕩反應后，在紫外光的激發下發射出很強的熒光，用時間分辨儀器測定其熒光強度。熒光強度與樣品中的HSA濃度成正比，對照標準曲線即可確定樣品中抗原的含量。?

本發明提供的時間分辨熒光免疫分析試劑盒包括以下組分：1)校準品、2)包被抗HSA抗體的96孔微孔板、3)銪標記抗CEA抗體、4)分析緩沖液、5)洗滌液(25x)，和6)增強液。?

根據本發明的一個優選實施方案，其特征在于試劑盒的包被抗HSA抗體的96孔微孔板制備：將包被緩沖液稀釋抗HSA抗體至適當濃度→包被至96孔微孔板→用封閉緩沖液封閉1小時→保存等步驟得到包被有抗HSA的96孔微孔反應板，其中包被緩沖液為：?

Tris-HCl(50-200mmol/L)、pH7.2緩沖液；封閉緩沖液由Tris-HCl(50-200mmol/L)、含0.1％-0.5％水解酪蛋白、5-10％蔗糖、pH7.2緩沖液組成。?

根據本發明的一個優選實施方案，其特征還在于試劑盒的銪標記抗HSA抗體的制備步驟為：選用抗HSA-單克隆抗體進行Eu³⁺標記，抗體與Eu³⁺標記物的比例為5∶1(質量比)為最佳比例，標記率太高，影響被標記抗體的免疫活性；標記率太低，信號強度不夠，降低檢測靈敏度。?

根據本發明的一個優選實施方案，其特征還在于試劑盒的校準品為：用含1～5g/L水解酪蛋白及1g/L?NaN₃的50mmol/l?pH7.8Tris-Hcl緩沖液，將HSA抗原配制成0μg/mL、1.23μg/mL、3.7μg/mL、11.1μg/mL、33.3μg/mL、100μg/mL系列濃度的校準溶液，按每瓶1mL分裝凍干，4℃保存。?