[發明專利]固定化酶連續水解白藜蘆醇苷制備白藜蘆醇的方法

無效

• 申請號: 201110410755.5
• 申請日: 2011-12-12
• 公開（公告）號: CN102492731A
• 公開（公告）日: 2012-06-13
• 發明（設計）人: 蘇昱;周小華;趙紅波;王丹;徐溢;徐煥煥
• 申請（專利權）人: 重慶大學
• 主分類號: C12P7/22
• 分類號: C12P7/22;C12N11/10;C07C39/21;C07C37/82;C07C37/84
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技術領域

本發明屬于白藜蘆醇技術領域，具體涉及白藜蘆醇的制備方法。

背景技術

白藜蘆醇(化學名為芪三酚)是含有芪類結構的非黃酮多酚類化合物，是植物在受到應激時自身合成的一種抗毒素，難溶于水，易溶于甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、氯仿等有機溶劑。主要有抗腫瘤、抗炎、抗菌、抗氧化、抗自由基、保護肝臟、保護心血管和抗心肌缺血等功能，被廣泛應用于食品保健品、化妝品及醫藥領域。

目前白藜蘆醇的生產主要是植物提取法。提取白藜蘆醇的植物有葡萄、花生、桑葚、虎杖等。然而，植物中的白藜蘆醇含量非常低，使得其分離純化成本偏高。而白藜蘆醇類似物白藜蘆醇苷在植物中的含量為白藜蘆醇的7～12倍，如果將白藜蘆醇苷轉化為白藜蘆醇，白藜蘆醇的產率可大大提高。酶法水解白藜蘆醇苷轉化為白藜蘆醇，因條件溫和，反應產物較單一，產率高，而被廣泛采用。

現有的制備白藜蘆醇的方法，如2008年9月3日公開的公開號為CN101255449的“β-葡萄糖苷酶在轉化白藜蘆醇苷制備白藜蘆醇中的應用”專利，公開的是以含白藜蘆醇苷的植物為原料，先利用微生物法發酵制得β-葡萄糖苷酶，再經酶轉化、離心、乙醇提純而得產品。該方法的主要缺點是：①利用微生物法發酵制得的β-葡萄糖苷酶在水解反應中是以游離狀態發揮催化作用，游離狀態的酶在水溶液中不穩定，對熱、強酸、強堿、高離子濃度、及有機溶劑等均敏感，容易失活。②游離狀態的酶難以與反應產物分離，導致產物純化困難，增加生產成本。③游離狀態的酶只能使用一次，酶的用量較大，不利于節約能源。④不能連續進行生產，延長了生產周期，對原料的利用率低。

發明內容

本發明的目的是針對現有制備白藜蘆醇方法的不足之處，提供一種固定化酶連續水解白藜蘆醇苷制備白藜蘆醇的方法。具有操作簡單實用、設備通用、酶穩定性好、重復利用率高、節約能源、無有害物質排放，清潔安全，生產成本低，可連續生產等特點。

本發明的主要原理是：在適宜條件下，以二醛類化合物與接枝賴氨酸殼聚糖微球的游離氨基及β-葡萄糖苷酶的游離氨基發生交聯反應，就將游離β-葡萄糖苷酶束縛于接枝賴氨酸殼聚糖微球載體，即制備出固定化酶；固定化酶具備與游離酶同樣的水解特性，可反復使用，連續水解白藜蘆醇苷，生成白藜蘆醇。

實現本發明目的的技術方案是：一種固定化酶連續水解白藜蘆醇苷制備白藜蘆醇的方法，以市售的賴氨酸修飾的殼聚糖微球陰離子交換樹脂、β-葡萄糖苷酶、白藜蘆醇苷和XAD-7HP大孔吸附樹脂為原料，先制備出固定化β-葡萄糖苷酶，后裝柱成柱式酶反應器，再經連續水解，吸附，洗脫，結晶得到白藜蘆醇產品。其具體步驟如下：

(1)配制β-葡萄糖苷酶緩沖溶液

以市售的β-葡萄糖苷酶為原料，按照β-葡萄糖苷酶的質量(mg)∶緩沖溶液體積(L)比為1∶0.5～1.5的比例，將β-葡萄糖苷酶加入緩沖溶液中，攪拌混合均勻，就制備出β-葡萄糖苷酶緩沖溶液。其中，所述的緩沖溶液為pH值6.0～8.0的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液。

(2)制備固定化β-葡萄糖苷酶

第(1)步完成后，以市售的賴氨酸修飾的殼聚糖微球陰離子交換樹為原料，按照賴氨酸修飾的殼聚糖微球陰離子交換樹脂的質量(g)∶第(1)步制備出得β-葡萄糖苷酶緩沖溶液的體積(mL)∶1％的戊二醛溶液的體積(mL)比為1∶10～20∶1～3的比例，先將賴氨酸修飾的殼聚糖微球陽離子交換樹脂加入到β-葡萄糖苷酶緩沖溶液中，攪拌吸附1～3小時后再加入戊二醛溶液，反應1～3小時后將反應產物放置于真空過濾器中，進行真空過濾，分別收集濾液和濾渣。對于收集的濾液，用于回收緩沖溶液。對于收集的濾渣，按照濾渣的質量(g)∶緩沖溶液體積(mL)之比為1∶10～50的比例，用緩沖溶液對糖渣進行洗滌，分別收集洗滌液和洗滌后的濾渣。再按洗滌后的濾渣的質量(g)∶緩沖溶液的體積(mL)之比為1∶10～50的比例，再用緩沖溶液對洗滌后的濾渣進行洗滌，分別收集洗滌液和洗滌后的濾渣。如此重復，直至洗滌液中檢測不出酶蛋白質為止。最后合并各次收集的洗滌液和第(2)步收集的濾液，用于回收緩沖溶液。對于洗滌后的濾渣，即為制得的固定化β-葡萄糖苷酶，用于組裝固定化β-葡萄糖苷酶柱式反應器。其中，所述的緩沖溶液為pH值6.0～8.0的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液

(3)制備白藜蘆醇苷水解液