[發(fā)明專利]固定化酶連續(xù)水解白藜蘆醇苷制備白藜蘆醇的方法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110410755.5
• 申請(qǐng)日: 2011-12-12
• 公開（公告）號(hào): CN102492731A
• 公開（公告）日: 2012-06-13
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 蘇昱;周小華;趙紅波;王丹;徐溢;徐煥煥
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 重慶大學(xué)
• 主分類號(hào): C12P7/22
• 分類號(hào): C12P7/22;C12N11/10;C07C39/21;C07C37/82;C07C37/84
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1.一種固定化酶連續(xù)水解白藜蘆醇苷制備白藜蘆醇的方法，其特征在于所述方法的具體步驟如下：

(1)配制β-葡萄糖苷酶緩沖溶液

以市售的β-葡萄糖苷酶為原料，按照β-葡萄糖苷酶的質(zhì)量∶緩沖溶液體積比為1mg∶0.5～1.5L的比例，將β-葡萄糖苷酶加入緩沖溶液中，攪拌混合均勻，其中，所述的緩沖溶液為pH值6.0～8.0的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液；

(2)制備固定化β-葡萄糖苷酶

第(1)步完成后，以市售的賴氨酸修飾的殼聚糖微球陰離子交換樹為原料，按照賴氨酸修飾的殼聚糖微球陰離子交換樹脂的質(zhì)量∶第(1)步制備出的β-葡萄糖苷酶緩沖溶液的體積∶1％的戊二醛溶液的體積比為1g∶10～20mL∶1～3mL的比例，先將賴氨酸修飾的殼聚糖微球陽離子交換樹脂加入到β-葡萄糖苷酶緩沖溶液中，攪拌吸附1～3小時(shí)后再加入戊二醛溶液，反應(yīng)1～3小時(shí)后將反應(yīng)產(chǎn)物放置于真空過濾器中，進(jìn)行真空過濾，分別收集濾液和濾渣，對(duì)于收集的濾渣，按照濾渣的質(zhì)量∶緩沖溶液體積之比為1g∶10～50mL的比例，用緩沖溶液對(duì)濾渣進(jìn)行洗滌，分別收集洗滌液和洗滌后的濾渣，再按洗滌后的濾渣的質(zhì)量∶緩沖溶液的體積之比為1g∶10～50mL的比例，再用緩沖溶液對(duì)洗滌后的濾渣進(jìn)行洗滌，分別收集洗滌液和洗滌后的濾渣，如此重復(fù)，直至洗滌液中檢測不出酶蛋白質(zhì)為止，最后合并各次收集的洗滌液和第(2)步收集的濾液，所述的緩沖溶液為pH值6.0～8.0的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液；

(3)制備白藜蘆醇苷水解液

第(2)步完成后，以市售的白藜蘆醇苷為原料，先將第(2)步制得的固定化β-葡萄糖苷酶裝入夾套保溫層析柱中，升溫至30～60℃，再按照市售的白藜蘆醇苷的質(zhì)量∶乙醇體積濃度為30～50％的乙醇溶液體積之比為1g∶0.5～1.5L的比例，將市售的白藜蘆醇苷加入到乙醇溶液中，攪拌至溶解，然后，將制得的白藜蘆醇苷溶液泵入到組裝的固定化β-葡萄糖苷酶柱式反應(yīng)器中，控制白藜蘆醇苷溶液的泵入速度為固定化β-葡萄糖苷酶柱式反應(yīng)器體積mL的2～6倍/小時(shí)，進(jìn)行連續(xù)水解反應(yīng)26～40小時(shí)，分別收集固定化β-葡萄糖苷酶柱式反應(yīng)器的流出液和固定化β-葡萄糖苷酶柱式反應(yīng)器；

(4)再生固定化β-葡萄糖苷酶柱式反應(yīng)器

第(3)步完成后，向第(3)步收集的固定化β-葡萄糖苷酶柱式反應(yīng)器中，泵入純凈水進(jìn)行清洗，控制純凈水泵入速度為固定化β-葡萄糖苷酶柱式反應(yīng)器體積mL的2～6倍/小時(shí)，直至清洗液中無白藜蘆醇苷和白黎蘆醇時(shí)止，分別收集清洗液和清洗后的固定化β-葡萄糖苷酶柱式反應(yīng)器；

(5)制備白藜蘆醇晶體

第(4)步完成后，以市售的活化的XAD-7HP大孔吸附樹脂為原料，先將市售活化的XAD-7HP大孔吸附樹脂裝入中壓層析柱中，先泵入第(3)步收集的白藜蘆醇苷水解液，控制白藜蘆醇苷水解液泵入速度為XAD-7HP大孔吸附樹脂柱體積的2～6倍/小時(shí)，直至流出液中出現(xiàn)白藜蘆醇為止，分別收集流出液和吸附白藜蘆醇的XAD-7HP大孔吸附樹脂柱，再將收集的吸附白藜蘆醇的XAD-7HP大孔吸附樹脂柱泵入等樹脂柱體積的蒸餾水進(jìn)行洗滌，分別收集洗滌液及洗滌后的吸附有白藜蘆醇的XAD-7HP大孔吸附樹脂柱，對(duì)于收集的洗滌后吸附有白藜蘆醇的XAD-7HP大孔吸附樹脂柱，按照XAD-7HP大孔吸附樹脂質(zhì)量∶乙醇體積濃度為50～90％的乙醇溶液體積之比為1g∶40～80mL的比例，向洗滌后的吸附白藜蘆醇的XAD-7HP大孔吸附樹脂柱泵入流速為2～6倍樹脂體積/小時(shí)的乙醇溶液，分別收集洗脫流出液和洗脫吸附有白藜蘆醇的XAD-7HP大孔吸附樹脂，然后合并洗脫流出液和再生XAD-7HP大孔吸附樹脂的洗滌液，并將該合并液泵入真空濃縮器中，在真空度為-0.6～-0.9MPa，溫度為75～90℃下，進(jìn)行真空濃縮，直至濃縮液中無乙醇?xì)馕稌r(shí)為止，分別收集白藜蘆醇濃縮液和蒸發(fā)液，最后將收集的白藜蘆醇濃縮液，泵入結(jié)晶罐中，進(jìn)行結(jié)晶24～36小時(shí)，結(jié)晶完成后，進(jìn)行過濾，分別收集濾渣和濾液，對(duì)于收集的晶體，置于真空烘箱中，于60-80℃干燥2-3小時(shí)，就制備出純度高達(dá)98-99％的白藜蘆醇晶體產(chǎn)品。