[發明專利]人溶菌酶-人堿性成纖維細胞生長因子融合基因的設計及表達

無效

• 申請號: 201110410610.5
• 申請日: 2011-12-12
• 公開（公告）號: CN102492674A
• 公開（公告）日: 2012-06-13
• 發明（設計）人: 鄔敏辰;韋敬土;龔燕燕;羅秋玲;劉曉彤
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N9/36
• 分類號: C12N9/36;C12N15/62;C12N15/10;C12N15/81;C12N1/19;C12R1/84
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技術領域

本發明涉及人溶菌酶-人堿性成纖維細胞生長因子融合基因的克隆、工程菌的構建及其高效表達的方法，屬于生物技術領域。

背景技術

人溶菌酶(Human?lysozyme，hLY)是一種能水解致病菌中黏多糖的堿性酶。主要通過破壞細胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之間的β-1，4-糖苷鍵，使細胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，導致細胞壁破裂內容物逸出而使細菌溶解。溶菌酶還可與帶負電荷的病毒蛋白直接結合，與DNA、RNA、脫輔基蛋白形成復鹽，使病毒失活。因此，該酶具有抗菌、消炎、抗病毒等作用。針對人溶菌酶的研究，對開發新的抗菌藥物具有重要的意義。

堿性成纖維細胞生長因子(basic?fibroblast?growthfactor，bFGF)是一種廣泛存在于人體各種組織中的生物活性物質，具有強烈的血管生成作用。在體外，能刺激細胞增殖、遷移，誘導纖溶酶原激活物及膠原酶活性，是與肝素有高親和力的細胞促分裂原。它被認為是血管生成刺激物、成纖維細胞增殖趨化因子、成肌細胞、角膜細胞、神經細胞生長的刺激物等，在體內參與多種組織的創傷修復過程，是體內重要的創傷愈合因子之一。

隨著抗生素的不斷使用，細菌耐藥性已成為現在醫學的一大難題，也是醫藥領域研究的一個重要方向。因此，人們越來越重視對抗菌藥物的研究，我們根據人溶菌酶與人堿性成纖維細胞生長因子的各自功能，同時考慮到兩種蛋白的空間結構以及人體傷口處具有多種凝血酶，因而用凝血酶蛋白切割位點(LVPRGS)將兩者融合，構建成新型的融合蛋白，目的是使融合蛋白應用在人體傷口處時能自動裂解成同時具抗菌和皮膚修復功能的多肽。

發明內容

本發明的目的是提供人溶菌酶-人堿性成纖維細胞生長因子融合基因的克隆、工程菌的構建及其高效表達的方法。

本發明的技術方案：利用重疊PCR技術，將人溶菌酶基因與人堿性成纖維細胞生長因子進行融合，中間引入凝血酶切位點。將經測序正確的融合基因連接入質粒pPIC9K，轉化畢赤酵母GS115，優化發酵條件，誘導表達重組融合蛋白。

所述融合蛋白的核苷酸和氨基酸序列分別為SEQ?ID?NO：1和SEQ?ID?NO：2。

所涉及到的pUCm-T-hly為本實驗室構建和保藏，pMD19-T-hbfgf為中山大學鄭有華博士所惠贈。

所述的人溶菌酶-人堿性成纖維細胞生長因子融合基因的克隆方法：利用重疊PCR合成融合基因，重疊PCR涉及到的兩對引物分別為(下劃線部分為凝血酶切位點的核苷酸序列)：

hLY-F：GAATTCAAGGTCTTTGAAAGGTGTGA，待融合的人溶菌酶基因片段的上游引物；

hLY-R：CATAGAACCTCTTGGAACCAACACTCCACAACCTTGAACAT，待融合的人溶菌酶基因片段的下游引物；

hbFGF-F1：GTGTTGGTTCCAAGAGGTTCTATGGCAGCCGGGAGCAT，待融合的人堿性成纖維細胞生長因子基因片段的上游引物；

hbFGF-R：GCGGCCGCTTAGCTCTTAGCAGACATTGGA，待融合的人堿性成纖維細胞生長因子基因片段的下游引物；

先分別PCR合成待融合基因的上下游片段，PCR產物用1％瓊脂糖凝膠電泳分析并割膠回收目的條帶。然后各取2uL上下游片段互為引物和模板進行嵌合酶基因的初步合成，最后加入hLY-F和hbFGF-R引物進行嵌合酶基因的大量擴增。將PCR產物用1％瓊脂糖凝膠電泳分析，割膠回收目的條帶并與質粒pUCm-T連接(pUCm-T-hly-thr-hbfgf)，轉化JM109，經酶切鑒定正確后送上海生工測序。

將測序結果正確的pUCm-T-hly-thr-hbfgf與pPIC9K質粒均用EcoR?I和Not?I進行雙酶切，割膠回收的酶切產物在T4DNA連接酶的作用下進行連接，得到重組質粒pPIC9K-hly-thr-hbfgf(圖1)，并對重組質粒進行序列測定。

所述的人溶菌酶-人堿性成纖維細胞生長因子融合基因工程菌構建的方法：將經測序正確的重組質粒pPIC9K-hly-thr-hbfgf經Sac?I線性化后，轉化畢赤酵母GS115，篩選得到高拷貝畢赤酵母重組子GS/hly-thr-hbfgf。