[發明專利]β-1,4-內切木聚糖酶(Aor Xyn11A)基因耐熱性改造的理性設計及雜合酶的制備

無效

• 申請號: 201110410553.0
• 申請日: 2011-12-12
• 公開（公告）號: CN102719457A
• 公開（公告）日: 2012-10-10
• 發明（設計）人: 鄔敏辰;高樹娟;張慧敏;李劍芳;汪俊卿
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N15/56
• 分類號: C12N15/56;C12N9/42;C12N15/62;C12N15/10;C12N15/63;C12N1/19;C12R1/84
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技術領域

本發明涉及源自米曲霉(Aspergillus?oryzae)CICC?40186菌株的常溫木聚糖酶(Aor?Xyn11A)基因進行熱穩定性的定向改造，雜合木聚糖酶工程菌的構建及重組雜合木聚糖酶的高效表達的方法，屬于生物工程技術領域。?

背景技術

木聚糖酶(EC?3.2.1.8)是一類重要的工業用酶。它主要是作用于木聚糖主鏈，隨機地切開木聚糖內部的木糖苷鍵，水解產物主要為不同聚合度的木寡糖和少量的木糖，是木聚糖降解酶中最關鍵的酶。近幾年，由于木聚糖酶在飼料工業、食品加工及釀造等行業具有潛在的工業應用和經濟價值，尤其是在工業造紙上的應用，減少因漂白產生的環境污染，受到了越來越多的關注。然而在許多工業中，木聚糖酶都需要在高溫條件下進行操作，因此對木聚糖酶耐熱性的研究也引起了國內外研究的高度重視。開發耐熱型木聚糖酶的研究主要包括篩選超耐熱的木聚糖酶生產菌和利用基因工程對酶分子進行定向改造，相對于篩菌技術的盲目性，后者具有更強的針對性，受到國內外學者的親睞。?

根據木聚糖酶催化區域的結構和性質分析，可將其分為不同的家族，其中以糖苷水解酶第10家族和第11家族居多。由于G/11家族的木聚糖酶分子量較小，且結構比較簡單，更適合作為理論研究的分子模型，可以用于極端條件下木聚糖酶催化模式系統及蛋白質分子折疊機理等的研究。基因工程技術、生物信息學以及計算機科學的快速發展，為分子生物學的研究開辟了新的前景。我們可以運用大規模高性能的計算機及其相關軟件，結合基因工程手段，利用模擬試驗對酶分子進行定向改造以提高熱穩定性，加速木聚糖酶在各種領域中的應用過程。?

發明內容

本發明的目的是提供一種新型地利用計算機技術與生物信息學方法對常溫的木聚糖酶進行理性設計，運用基因工程的方法構建雜合木聚糖酶工程菌以及重組雜合木聚糖酶的高效表達的方法。將源自A.oryzae?CICC?40186的第11家族的木聚糖酶命名為Aor?Xyn11A，其相應的基因命名為Aor?xyn11A；采用的模板為同家族的超耐熱木聚糖酶，將其命名為EvXynA^TS，基因序列為EvXynA^TS；由定向改造得到的兩種雜合木聚糖酶分別命名為α-Aor?xyn11A^TS和β-Aor?xyn11A^TS，其相應的基因為α-Aor?xyn11A^TS和β-Aor?xyn11A^TS，其熱穩定性有了很大的提?高，有較大的工業化生產和應用潛力以及經濟價值。?

本發明的技術方案：一種來源于A.oryzae?CICC?40186的木聚糖酶基因(Aor?xyn11A)在計算機輔助下進行理性設計，得到兩種雜合木聚糖酶：α-Aor?Xyn11A^TS，其完整的mRNA序列分別為SEQ?ID?NO：1，及β-Aor?Xyn11A^TS，其完整的mRNA序列為SEQ?ID?NO：3。這兩種酶統稱為Aor?Xyn11A^TS。?

A.oryzae菌株購于中國工業微生物菌種保藏中心(China?Center?of?Industrial?Culture?Collection，CICC)，編號為40186。?

所述的由完整mRNA推導的α-Aor?Xyn11A^TS和β-Aor?Xyn11A^TS氨基酸序列分別為SEQ?ID?NO：2和SEQ?ID?NO：4。?

所述的重組木聚糖酶的活性測定方法：?

于25mL具塞試管A和B中，各加入用pH?4.6、檸檬酸-Na₂HPO₄緩沖液配制的質量濃度為0.5％的樺木木聚糖(Sigma，USA)溶液2.4mL，50℃預熱10min，在A管中加入0.1mL適當稀釋的酶液，50℃準確反應15min；立即各加入2.5mL?3′，5′-二硝基水楊酸(DNS)試劑，在B管中再補加0.1mL酶液，A和B管均煮沸7min；冷卻后各加去離子水5mL，搖勻；540nm處以B管為空白對照測定A管吸光度值，并從木糖標準曲線上查出相應的還原糖(以木糖計)含量并折算成酶活性單位。酶活性單位定義：在本測定條件下，以每分鐘產生1μmol還原糖所需的酶量定義為1個木聚糖酶活性單位(IU)。?

所述的耐熱雜合木聚糖酶基因的設計、克隆及表達：?