[發明專利]β-1,4-內切木聚糖酶(Aor Xyn11A)基因耐熱性改造的理性設計及雜合酶的制備

無效

• 申請號: 201110410553.0
• 申請日: 2011-12-12
• 公開（公告）號: CN102719457A
• 公開（公告）日: 2012-10-10
• 發明（設計）人: 鄔敏辰;高樹娟;張慧敏;李劍芳;汪俊卿
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N15/56
• 分類號: C12N15/56;C12N9/42;C12N15/62;C12N15/10;C12N15/63;C12N1/19;C12R1/84
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1.一種源自米曲霉(Aspergillus?oryzae)CICC?40186、歸屬于糖苷水解酶第11家族的常溫木聚糖酶基因Aor?xyn11A，以另一個同家族的超耐熱木聚糖酶基因EvXynA^TS為模板，利用計算機技術及其相關軟件，結合分子動力學模擬的方法，對Aor?Xyn11A分子進行理性設計，定向改造以提高熱穩定性。

2.利用分子動力學模擬的方法理性設計熱穩定性提高的雜合基因：

(1)同源建模模擬Aor?Xyn11A的空間結構：登錄蛋白質結構數據庫Protein?data?bank(http://rcsb.org)，經BLAST比對，找到與Aor?Xyn11A具有高度同源的序列；本實驗選擇熱穩定非常高的EvXynA^TS(Protein?Data?Bank登錄號為2VUL)為模板，并且兩者的同源性為66.49％，運用SWISS-MODEL服務器在線全自動為A.oryzae常溫木聚糖酶成熟肽構建空間結構；運用軟件Verify_3D對同源建模的結構模型進行評估和優化，獲得準確性較高的空間結構模型；

(2)利用分子動力學模擬的方法理性設計熱穩定性提高的雜合基因：使用GROMACS4.0軟件對由(1)得到的Aor?Xyn11A空間結構和耐熱型EvXynA^TS分別進行分子動力學模擬；采用的力場是GROMOS96力場，該力場中蛋白的立場參數數據均給予實驗值擬合；模擬溫度為300K，溶劑采用TIP3P水模型；對于每個模擬體系，均在溶質外圍加上1.5nm的水分子層；MD模擬之前，對體系分別進行了兩次能量優化，首先約束溶質，用最陡下降法優化800步，再用共軛梯度法優化1200步；然后去約束后再進行800步最陡下降法優化，1200步共軛梯度法優化；MD模擬分為兩步：首先進行20ps的約束溶質分子的MD模擬，此時溫度從0K逐步升高到300K；接著進行500ps的無約束恒溫MD模擬；最后分別得到常溫Aor?Xyn11A和超耐熱EvXynA^TS總體能量和RMSD值及Aor?Xyn11A各個氨基酸的B-factor值；

我們分別將由MD得到的Aor?Xyn11A和已知的EvXynA^TS各個氨基酸的B-factor值導入到PDB文件中，使用B-FITTER軟件導出各個氨基酸的B-factor值，由作圖可以看出EvXynA^TS序列中各氨基酸的柔性較小，波動幅度較為平均，而Aor?Xyn11A序列尤其是N端較為不穩定，可通過N端序列替換方法進行分子改造；我們分別隨機選取Aor?Xyn11A的N端適當氨基酸數分別用EvXynA^TS相應的序列進行替換改造，然后我們以EvXynA^TS為模板，分別對雜合木聚糖酶進行同源建模，然后運用分子動力學模擬方法分別對雜合蛋白進行計算總體能量及RMSD值。由結果我們得出將Aor?Xyn11A的N端37個氨基酸由EvXynA^TS的N端42個氨基酸替換，即α-Aor?Xyn11A^TS，及62個EvXynA^TS替換Aor?Xyn11A的N端57個氨基酸，即β-Aor?Xyn11A^TS，這兩種雜合酶的總體能量和RMSD值相對較小，即熱穩定性較好。

3.雜合木聚糖酶工程菌的構建和表達方法：

(1)雜合基因α-Aor?xyn11A^TS和β-Aor?xyn11A^TS及其表達質粒的構建：根據GenBank上EvXynA^TS基因序列(登錄號為EU?591743.1)設計引物EF，與Aor?xyn11A公用引物TM1和TM2：

EF：5′-GAATTCAACGCTCAAACTTGTCTTACC-3′，含EcoR?I酶切位點

TM1：5′-TGCCGACGTTGGACCAGTTAGAAGTGTAACGA-3′，含公共序列

TM2：5′-GAAGCTTCCGGAGTAGGTGATGTTACGACGACTTCCAG-3′

采用重疊PCR技術構造雜合基因，主要分為三步：以EF和TM1為引物進行第一輪PCR(94℃2min；30個循環，94℃30s，55℃30s，72℃12s；72℃10min)；以第一輪的反應液和Xyn11A-R為引物進行第二輪PCR(94℃2min；10個循環，94℃30s，52℃30s，72℃40s；72℃10min)；EF在冰上直接加入到上述PCR管中，以AF和Xyn11A-R為引物進行第三輪PCR(94℃2min；30個循環，94℃30s，52℃30s，72℃40s；72℃10min)；將第三輪PCR目的條帶進行克隆、測序；測序正確的pUCm-T-α-Aor?xyn11A^TS與pPIC9K質粒均用EcoR?I和Not?I進行雙酶切，回收的酶切產物在T4DNA連接酶的作用下進行連接，得到重組質粒pPIC9K-α-Aor?xyn11A^TS，并對重組表達質粒進行序列測定；以同樣的方法得到pUCm-T-β-Aor?xyn11A^TS和pPIC9K-β-Aor?xyn11A^TS，并送去測序；

(2)GS115/α-Aor?xyn11A^TS和GS115/β-Aor?xyn11A^TS重組子的構建、表達及酶活的測定：用Sal?I對pPIC9K-α-Aor?xyn11A^TS和pPIC9K-β-Aor?xyn11A^TS分別進行線性化，按照畢赤酵母表達手冊進行電轉化、篩選，得到高拷貝的畢赤酵母重組子GS115/α-Aor?xyn11A^TS和GS115/β-Aor?xyn11A^TS；該工程菌用1.0％甲醇誘導72h；離心上清液為重組木聚糖酶粗酶液，經SDS-PAGE檢測均為單一條帶，顯示重組木聚糖酶α-Aor?xyn11A^TS和β-Aor?xyn11A^TS分子量分別約為25kDa和29kDa，重組木聚糖酶最適反應溫度分別為75℃和80℃。