[發(fā)明專利]β-1,4-內(nèi)切木聚糖酶(Aor Xyn11A)基因耐熱性改造的理性設(shè)計(jì)及雜合酶的制備

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110410553.0
• 申請(qǐng)日: 2011-12-12
• 公開（公告）號(hào): CN102719457A
• 公開（公告）日: 2012-10-10
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 鄔敏辰;高樹娟;張慧敏;李劍芳;汪俊卿
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 江南大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/56
• 分類號(hào): C12N15/56;C12N9/42;C12N15/62;C12N15/10;C12N15/63;C12N1/19;C12R1/84
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1.一種源自米曲霉(Aspergillus?oryzae)CICC?40186、歸屬于糖苷水解酶第11家族的常溫木聚糖酶基因Aor?xyn11A，以另一個(gè)同家族的超耐熱木聚糖酶基因EvXynA^TS為模板，利用計(jì)算機(jī)技術(shù)及其相關(guān)軟件，結(jié)合分子動(dòng)力學(xué)模擬的方法，對(duì)Aor?Xyn11A分子進(jìn)行理性設(shè)計(jì)，定向改造以提高熱穩(wěn)定性。

2.利用分子動(dòng)力學(xué)模擬的方法理性設(shè)計(jì)熱穩(wěn)定性提高的雜合基因：

(1)同源建模模擬Aor?Xyn11A的空間結(jié)構(gòu)：登錄蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫Protein?data?bank(http://rcsb.org)，經(jīng)BLAST比對(duì)，找到與Aor?Xyn11A具有高度同源的序列；本實(shí)驗(yàn)選擇熱穩(wěn)定非常高的EvXynA^TS(Protein?Data?Bank登錄號(hào)為2VUL)為模板，并且兩者的同源性為66.49％，運(yùn)用SWISS-MODEL服務(wù)器在線全自動(dòng)為A.oryzae常溫木聚糖酶成熟肽構(gòu)建空間結(jié)構(gòu)；運(yùn)用軟件Verify_3D對(duì)同源建模的結(jié)構(gòu)模型進(jìn)行評(píng)估和優(yōu)化，獲得準(zhǔn)確性較高的空間結(jié)構(gòu)模型；

(2)利用分子動(dòng)力學(xué)模擬的方法理性設(shè)計(jì)熱穩(wěn)定性提高的雜合基因：使用GROMACS4.0軟件對(duì)由(1)得到的Aor?Xyn11A空間結(jié)構(gòu)和耐熱型EvXynA^TS分別進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)模擬；采用的力場(chǎng)是GROMOS96力場(chǎng)，該力場(chǎng)中蛋白的立場(chǎng)參數(shù)數(shù)據(jù)均給予實(shí)驗(yàn)值擬合；模擬溫度為300K，溶劑采用TIP3P水模型；對(duì)于每個(gè)模擬體系，均在溶質(zhì)外圍加上1.5nm的水分子層；MD模擬之前，對(duì)體系分別進(jìn)行了兩次能量?jī)?yōu)化，首先約束溶質(zhì)，用最陡下降法優(yōu)化800步，再用共軛梯度法優(yōu)化1200步；然后去約束后再進(jìn)行800步最陡下降法優(yōu)化，1200步共軛梯度法優(yōu)化；MD模擬分為兩步：首先進(jìn)行20ps的約束溶質(zhì)分子的MD模擬，此時(shí)溫度從0K逐步升高到300K；接著進(jìn)行500ps的無約束恒溫MD模擬；最后分別得到常溫Aor?Xyn11A和超耐熱EvXynA^TS總體能量和RMSD值及Aor?Xyn11A各個(gè)氨基酸的B-factor值；

我們分別將由MD得到的Aor?Xyn11A和已知的EvXynA^TS各個(gè)氨基酸的B-factor值導(dǎo)入到PDB文件中，使用B-FITTER軟件導(dǎo)出各個(gè)氨基酸的B-factor值，由作圖可以看出EvXynA^TS序列中各氨基酸的柔性較小，波動(dòng)幅度較為平均，而Aor?Xyn11A序列尤其是N端較為不穩(wěn)定，可通過N端序列替換方法進(jìn)行分子改造；我們分別隨機(jī)選取Aor?Xyn11A的N端適當(dāng)氨基酸數(shù)分別用EvXynA^TS相應(yīng)的序列進(jìn)行替換改造，然后我們以EvXynA^TS為模板，分別對(duì)雜合木聚糖酶進(jìn)行同源建模，然后運(yùn)用分子動(dòng)力學(xué)模擬方法分別對(duì)雜合蛋白進(jìn)行計(jì)算總體能量及RMSD值。由結(jié)果我們得出將Aor?Xyn11A的N端37個(gè)氨基酸由EvXynA^TS的N端42個(gè)氨基酸替換，即α-Aor?Xyn11A^TS，及62個(gè)EvXynA^TS替換Aor?Xyn11A的N端57個(gè)氨基酸，即β-Aor?Xyn11A^TS，這兩種雜合酶的總體能量和RMSD值相對(duì)較小，即熱穩(wěn)定性較好。

3.雜合木聚糖酶工程菌的構(gòu)建和表達(dá)方法：

(1)雜合基因α-Aor?xyn11A^TS和β-Aor?xyn11A^TS及其表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建：根據(jù)GenBank上EvXynA^TS基因序列(登錄號(hào)為EU?591743.1)設(shè)計(jì)引物EF，與Aor?xyn11A公用引物TM1和TM2：

EF：5′-GAATTCAACGCTCAAACTTGTCTTACC-3′，含EcoR?I酶切位點(diǎn)

TM1：5′-TGCCGACGTTGGACCAGTTAGAAGTGTAACGA-3′，含公共序列

TM2：5′-GAAGCTTCCGGAGTAGGTGATGTTACGACGACTTCCAG-3′

采用重疊PCR技術(shù)構(gòu)造雜合基因，主要分為三步：以EF和TM1為引物進(jìn)行第一輪PCR(94℃2min；30個(gè)循環(huán)，94℃30s，55℃30s，72℃12s；72℃10min)；以第一輪的反應(yīng)液和Xyn11A-R為引物進(jìn)行第二輪PCR(94℃2min；10個(gè)循環(huán)，94℃30s，52℃30s，72℃40s；72℃10min)；EF在冰上直接加入到上述PCR管中，以AF和Xyn11A-R為引物進(jìn)行第三輪PCR(94℃2min；30個(gè)循環(huán)，94℃30s，52℃30s，72℃40s；72℃10min)；將第三輪PCR目的條帶進(jìn)行克隆、測(cè)序；測(cè)序正確的pUCm-T-α-Aor?xyn11A^TS與pPIC9K質(zhì)粒均用EcoR?I和Not?I進(jìn)行雙酶切，回收的酶切產(chǎn)物在T4DNA連接酶的作用下進(jìn)行連接，得到重組質(zhì)粒pPIC9K-α-Aor?xyn11A^TS，并對(duì)重組表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行序列測(cè)定；以同樣的方法得到pUCm-T-β-Aor?xyn11A^TS和pPIC9K-β-Aor?xyn11A^TS，并送去測(cè)序；

(2)GS115/α-Aor?xyn11A^TS和GS115/β-Aor?xyn11A^TS重組子的構(gòu)建、表達(dá)及酶活的測(cè)定：用Sal?I對(duì)pPIC9K-α-Aor?xyn11A^TS和pPIC9K-β-Aor?xyn11A^TS分別進(jìn)行線性化，按照畢赤酵母表達(dá)手冊(cè)進(jìn)行電轉(zhuǎn)化、篩選，得到高拷貝的畢赤酵母重組子GS115/α-Aor?xyn11A^TS和GS115/β-Aor?xyn11A^TS；該工程菌用1.0％甲醇誘導(dǎo)72h；離心上清液為重組木聚糖酶粗酶液，經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)均為單一條帶，顯示重組木聚糖酶α-Aor?xyn11A^TS和β-Aor?xyn11A^TS分子量分別約為25kDa和29kDa，重組木聚糖酶最適反應(yīng)溫度分別為75℃和80℃。