[發明專利]β-1,4-內切甘露聚糖酶(An Man5A)基因的克隆與表達

無效

• 申請號: 201110410537.1
• 申請日: 2011-12-12
• 公開（公告）號: CN102392037A
• 公開（公告）日: 2012-03-28
• 發明（設計）人: 李劍芳;趙順閣;鄔敏辰;唐存多;魏喜換
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N15/56
• 分類號: C12N15/56;C12N9/42;C12N15/10;C12N1/19;C12N15/81;C12R1/685;C12R1/84
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1.一種來源于黑曲霉(Aspergillus?niger)LW-1的新型的酸性β-甘露聚糖酶基因(An?man5A)，其完整的mRNA和DNA的核苷酸序列分別對應于序列表中的SEQ?ID?NO：1和SEQ?ID?NO：2。

2.如權利要求1所述的甘露聚糖酶基因(An?man5A)編碼的酸性β-甘露聚糖酶(An?Man5A)，其完整的氨基酸序列對應于序列表中的SEQ?ID?NO：3。

3.A.niger?LW-1酸性β-甘露聚糖酶基因全基因序列獲得的方法：

(1)An?man5A?3′端cDNA序列的合成：首先對Aspergillus?aculeatus、Aspergillus?fumigatus和Aspergillus?sulphureus的β-甘露聚糖酶的氨基酸序列進行同源比對，找出兩段約10個氨基酸的保守序列；然后對它們的mRNA進行同源比對，尋找出對應的核苷酸序列后設計兩條簡并引物ManF1和ManF2；

ManF1：5′-GCTACTTYGCSGGVACSAAC-3′

ManF2：5′-TCDACVATCAACACKGGNGC-3′

按照TaKaRa生產的RNA?PCR?Kit(AMV)Ver.3.0中的說明書進行RT-PCR：以Oligo?dT-Adaptor?Primer為引物進行反轉錄合成cDNA的第一條鏈；以M13Primer?M4和ManF1為引物進行第一輪PCR(94℃，2min；94℃，30s，53℃，30s，72℃，90s，30個循環；72℃，10min)；以第一輪的PCR產物為模板、M13Primer?M4和ManF2為引物進行第二輪PCR(94℃，2min；94℃，30s，53℃，30s，72℃，90s，30個循環；72℃，10min)；將兩輪PCR產物用1％瓊脂糖凝膠電泳分析，將目的條帶割膠回收并與pUCm-T連接，轉化JM109獲重組質粒pUCm-T-Anman5A3′，經酶切鑒定后送上海生工進行序列測定，得出A.nigerLW-1酸性β-甘露聚糖酶基因3′端mRNA序列；

(2)An?man5A?5′端mRNA序列的合成：以A.nigerLW-1β-甘露聚糖酶基因3′端cDNA序列設計兩條擴增5′端mRNA序列的反向引物Man5A-R1和Man5A-R2；

ManR1：5′-ATTGTCGATTTGCCGTCCTG-3′

ManR2：5′-GCAGTTGGTACCAGACTGTG-3′

按照TaKaRa生產的5′-Full?RACE?Kit中的說明書進行5′-RACE：以5′RACE?Outer?Primer和ManR1為引物進行第一輪PCR(94℃，3min；30個循環，94℃，30s，55℃，30s，72℃，1min；72℃，10min)；以第一輪的PCR產物為模板，5′RACE?Inner?Primer和ManR2為引物進行第二輪PCR(94C，3min；94℃，30s，55℃，30s，72℃，1min，30個循環；72℃，10min)；將兩輪PCR產物用1％瓊脂糖凝膠電泳分析將目的條帶割膠回收并與pUCm-T連接，轉化JM109獲重組質粒pUCm-T-Anman5A5′，經酶切鑒定后送上海生工進行序列測定，得出A.niger?LW-1酸性β-甘露聚糖酶基因5′端mRNA序列；

(3)An?man5A5′端調控序列的合成：利用我們前期報道的連接介導PCR方法，以經處理的A.niger?LW-1基因組DNA為模板，以LD和ManR1為引物進行第一輪PCR(94℃，4min；30個循環，94℃，30s，53℃，30s，72℃，30s；72℃，10min)；然后以第一輪PCR產物為模板、LD和ManR2為引物進行第二輪PCR(94℃，4min；30個循環，94℃，30s，55℃，30s，72℃，30s；72℃，10min)；將兩輪PCR產物用1％瓊脂糖凝膠電泳分析，將目的條帶割膠回收并與pUCm-T連接，轉化JM109獲重組質粒pUCm-T-Anman5AP，經酶切鑒定后送上海生工進行序列測定，得出A.niger?LW-1β-甘露聚糖酶基因5′端調控序列；

(4)An?man5A?3′端調控序列的合成：以A.niger?LW-1β-甘露聚糖酶基因3′端cDNA序列設計兩條擴增3′端調控序列的正向引物Man5A-F1和Man5A-F2；

ManF3：5′-GGGAATACTATCTACTATGGG-3′

ManF4：5′-GTGATTATCAGTGCCTGGTG-3′

利用我們前期報道的T載體介導PCR方法，以T-PrimerR和ManF3為引物進行第一輪PCR(94℃，4min；94℃，30s，55℃，30s，72℃，1min，30個循環；72℃，10min)；然后以第一輪PCR產物為模板、T-PrimerR和ManF4為引物進行第二輪PCR(94℃，4min；94℃，30s，55℃，30s，72℃，1min，30個循環；72℃，10min)；將兩輪PCR產物用1％瓊脂糖凝膠電泳分析，250bp?DNA?Ladder?Marker做對照，將目的條帶割膠回收并與pUCm-T連接，轉化JM109獲重組質粒pUCm-T-Anman5A3T，經酶切鑒定后送上海生工進行序列測定，得出A.niger?LW-1酸性β-甘露聚糖酶基因3′端調控序列；

(5)A.niger?LW-1β-甘露聚糖酶基因的生物信息學分析：將man5A的5′端cDNA與3′端cDNA進行序列拼接，得到轉錄起始位點至PolyA的cDNA序列，在NCBI上進行開放閱讀框架(Open?Reading?Frame)分析，進而推測出Man5A的氨基酸序列，然后進行信號肽預測；將cDNA序列與兩側調控序列進行拼接，然后進行啟動子區域預測和PolyA加尾信號預測；

(6)An?man5A內含子序列的測定：以A.niger?LW-1的基因組DNA為模板，Man5A-F1和Man5A-R為引物進行PCR(94℃，4min；30個循環，94℃，30s，53℃，30s，72℃，2min；72℃，10min)，將PCR產物用1％瓊脂糖凝膠電泳分析，250bp?DNA?Ladder?Marker做對照，將目的條帶割膠回收并與pUCm-T連接，轉化JM109獲重組質粒pUCm-T-Anman5A-DNA，經酶切鑒定后送上海生工進行序列測定，得出A.niger?LW-1β-甘露聚糖酶編碼區的DNA序列；將DNA序列與cDNA用DNAMAN?6.0進行序列比對，便能得出A.niger?LW-1β-甘露聚糖酶基因內含子序列。

4.An?Man5A工程菌的構建和表達方法

(1)含編碼AnMan5A成熟肽基因的表達質粒的構建：以Oligo?dT-Adaptor?Primer為引物反轉錄合成cDNA的第一條鏈；以M13Primer?M4和Man5A-F為引物進行第一輪PCR(94℃2min；30個循環，94℃30s，53℃30s，72℃90s；72℃10min)；以Man5A-F和Man5A-R為引物第二輪PCR(94℃2min；30個循環，94℃30s，55℃30s，72℃90s；72℃10min)。將兩輪PCR產物用1％瓊脂糖凝膠電泳分析，割膠回收目的條帶并與pUCm-T連接(pUCm-T-man5A)，轉化JM109，經酶切鑒定正確后送上海生工測序；將測序正確的pUCm-T-man5A與pPICZαA質粒均用EcoR?I和Not?I進行雙酶切，割膠回收的酶切產物在T4DNA連接酶的作用下進行連接，得到重組質粒pPICZoA-man5A，并對重組表達質粒進行序列測定；

(2)GS115/man5A的構建、表達、產物純化及活性測定：用Sac?I對pPICZαA-man5A進行線性化，按照畢赤酵母表達手冊進行電轉化、篩選，得到高拷貝的畢赤酵母重組子GS115/man5A；該工程菌用1.0％甲醇誘導96h，DNS法測得發酵液中重組甘露聚糖酶活性達29.05IU/M1；離心上清液為重組甘露聚糖酶粗酶液，經飽和度為80％硫酸銨鹽析，截留分子量為10kDa的超濾膜濃縮，再經Sephadex?G-75凝膠過濾層析純化，純化后經SDS-PAGE檢測為單一條帶，并顯示重組甘露聚糖酶分子量為52.0kDa；該重組甘露聚糖酶最適作用溫度70℃，最適作用pH?4.0，該酶在pH?2.5～7.5、60℃以下穩定。