[發明專利]β-1,4-內切甘露聚糖酶(An Man5A)基因的克隆與表達

無效

• 申請號: 201110410537.1
• 申請日: 2011-12-12
• 公開（公告）號: CN102392037A
• 公開（公告）日: 2012-03-28
• 發明（設計）人: 李劍芳;趙順閣;鄔敏辰;唐存多;魏喜換
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N15/56
• 分類號: C12N15/56;C12N9/42;C12N15/10;C12N1/19;C12N15/81;C12R1/685;C12R1/84
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技術領域

本發明涉及源自黑曲霉(Aspergillus?niger)LW-1菌株的一種新型的酸性β-1，4-甘露聚糖酶基因完整mRNA和DNA的克隆與分析，β-1，4-甘露聚糖酶工程菌的構建以及重組β-1，4-甘露聚糖酶的高效表達和純化的方法，屬于生物工程技術領域。?

背景技術

甘露聚糖是由特定的單糖殘基(主要是甘露糖、葡萄糖和半乳糖)以α-和/或β-糖苷鍵連接而成的一類多糖的總稱。在自然界儲量豐富，僅次于木聚糖是植物半纖維素的第二大組分。由于其結構的復雜性，甘露聚糖的完全降解需要β-1，4-甘露聚糖酶，β-甘露糖苷鍵，β-葡糖苷酶以及α-半乳糖苷酶等的共同作用。?

β-1，4-甘露聚糖酶(β-1，4-D-mannanase?EC?3.2.1.78)是一類能夠水解甘露聚糖中的β-1，4-D-甘露糖苷鍵的內切酶，屬于半纖維素酶。能夠產生甘露聚糖酶的微生物有很多，包括絲狀真菌、細菌、放線菌等。過去20年中，有大量的甘露聚糖酶被分離純化出來，它們的基因已經被克隆，并在大腸桿菌、釀酒酵母、畢氏酵母等表達系統中進行了表達。甘露聚糖酶已廣泛應用于飼料、造紙、食品和石油開采等工業領域。近年來，隨著對自然界中半纖維素資源的開發、飼糧中甘露聚糖抗營養因子的消除以及甘露寡糖生理功能的發現，β-甘露聚糖酶的需求量越來越大，導致對β-甘露聚糖酶的研究和開發進入一個新高潮。但就國內外相關文獻或專利報道來看，微生物β-甘露聚糖酶發酵酶活性普遍不高，導致了生產成本很高，從而阻礙了該酶在眾多領域中的廣泛應用。為了提高β-甘露聚糖酶的發酵產率和酶活性，早期的研究工作主要集中在產酶菌種的篩選、誘變、產酶誘導，酶的分離純化及性質，酶水解底物方式及應用等方面。進入90年代，隨著基因工程技術和蛋白質工程技術的廣泛應用，研究工作逐步轉向酶基因的克隆和表達以及酶活性位點的研究等方面。目前，雖已有一些有關β-甘露聚糖酶基因的克隆和表達的文獻和專利報道，但有關來源于黑曲霉(Aspergillus?niger)β-甘露聚糖酶基因的克隆和表達等的研究未見有報道。?

發明內容

本發明的目的是提供一種新型的酸性β-1，4-甘露聚糖酶基因完整mRNA序列的克隆和分析，β-1，4-甘露聚糖酶工程菌的構建以及重組β-1，4-甘露聚糖酶的高效表達和純化的方法。根據Henrissat等人提出的糖苷水解酶分類法，大多甘露聚糖酶屬于糖苷水解酶第5和26家族。?生物信息學分析表明該基因所編碼的β-1，4-甘露聚糖酶屬于糖苷水解酶第5家族，命名為An?Man5A，其對應的基因命名為An?man5A。AnMan5A具有較高的催化活性和熱穩定性，有較大的工業化生產和應用潛力以及經濟價值。?

本發明的技術方案：一種源自A.niger?LW-1的β-1，4-甘露聚糖酶基因(An?man5A)，其完整mRNA和DNA序列分別為SEQ?ID?NO：1和SEQ?ID?NO：2。獲取完整mRNA和DNA序列的流程如圖1所示。?

A.nigerLW-1菌株由江南大學篩選和保藏，已于2007年在《食品與生物技術》雜志Vol.26，No.4，Pg.89公開，本發明人承諾該菌株在20年內向公眾發放。?

所述的完整mRNA序列推導的An?Man5A氨基酸序列為SEQ?ID?NO：3。?

所述的重組An?Man5A的活性測定方法：?

于25mL具塞試管A和B中，各加入用pH?3.6檸檬酸-Na₂HPO₄緩沖液配制的質量濃度為5g/L的角豆膠(Sigma，USA)溶液2.4mL，50℃預熱5-10min，在A管中加入0.1mL適當稀釋的酶液，50℃反應10min；立即各加入2.5mL?3′，5′-二硝基水楊酸(DNS)試劑，在B管中再補加0.1mL酶液，A和B管均煮沸7min；冷卻后各加入去離子水5mL，搖勻；540nm處以B管為空白對照測定A管吸光度值，并從木糖標準曲線上查出相應的還原糖(以甘露糖計)含量并折算成酶活性單位。酶活性單位定義：在本測定條件下，以每分鐘產生1μmol還原糖所需的酶量定義為1個甘露糖酶活性單位(IU)。?

所述的An?Man5A完整mRNA和DNA序列的克隆和表達方法：?