[發(fā)明專利]β-1,4-內(nèi)切葡聚糖酶(TviCel5A)基因的克隆及表達(dá)

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110410457.6
• 申請(qǐng)日: 2011-12-12
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102392034A
• 公開(kāi)（公告）日: 2012-03-28
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 鄔敏辰;陳忠法;汪俊卿;羅秋玲;龔燕燕
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 江南大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/56
• 分類號(hào): C12N15/56;C12N9/42;C12N15/10;C12N15/81;C12R1/885;C12R1/84
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技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及來(lái)源于綠色木霉(Trichoderma?viride)WL?0422的一種β-1，4-內(nèi)切葡聚糖酶基因cDNA序列的克隆及表達(dá)，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。?

背景技術(shù)

纖維素酶(Cellulase)是降解纖維素生成葡萄糖的一組酶的總稱，它不是單成分酶，而是由多個(gè)酶起協(xié)同作用的多酶體系，纖維素酶是由外切葡聚糖酶(exo-cellobiohydrolases，CBH)、內(nèi)切葡聚糖酶(endoglucanases，EG)以及β-葡聚糖苷酶(β-glucosidases，BG)組成復(fù)合酶系。其中內(nèi)切葡聚糖酶是纖維素酶系最主要的成分，它首先作用于纖維素，隨機(jī)水解纖維素分子內(nèi)部的糖苷鍵，將纖維素鏈打斷，它對(duì)整個(gè)纖維素的降解過(guò)程中起關(guān)鍵的作用。綠色木霉(Trichoderma?viride)、里氏木霉(Trichoderma?reesei)和康寧木霉(Trichoderma?koningii)等是近年來(lái)研究較多的產(chǎn)纖維素酶絲狀真菌。木霉所產(chǎn)的纖維素酶系統(tǒng)包括5種內(nèi)切葡聚糖酶，即EG?I、EG?II、EGIII、EGIV和EGV，而EG?II是主要作用成分。隨著纖維素酶的廣泛應(yīng)用，關(guān)于纖維素酶的研究也越來(lái)越多，目前人們已經(jīng)從20多種細(xì)菌和數(shù)種真菌中克隆得到百余個(gè)纖維素酶的基因，其中一些酶的基因核苷酸序列已被測(cè)定并在大腸桿菌和酵母中得到了表達(dá)。基因的克隆既可以直接用于研究酶的結(jié)構(gòu)與功能，也可為酶的合成調(diào)控與降解機(jī)制研究提供了工具與手段。?

畢赤酵母(Pichia?pastoris)表達(dá)系統(tǒng)是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的真核表達(dá)系統(tǒng)，其不僅具有大腸桿菌繁殖快、易于培養(yǎng)、遺傳操作簡(jiǎn)單和易于工業(yè)化生產(chǎn)等原核生物的特點(diǎn)，還具有真核生物基因表達(dá)調(diào)控和蛋白修飾功能，如糖基化、蛋白磷酸化等，避免了產(chǎn)物形成包涵體，活性降低等問(wèn)題。基于以上原因，畢赤酵母是表達(dá)木霉內(nèi)切葡聚糖酶較好的系統(tǒng)之一。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種T.virideWL?0422菌株β-1，4-內(nèi)切葡聚糖酶基因cDNA序列克隆，β-內(nèi)切葡聚糖酶工程菌的構(gòu)建以及重組β-內(nèi)切葡聚糖酶的高效表達(dá)和純化方法。生物信息學(xué)分析表明，來(lái)源于T.viride?WL0422菌株的β-內(nèi)切葡聚糖酶屬于糖苷水解酶第5家族，命名為Tvi?Cel5A，其相應(yīng)的基因命名為Tvi?cel5A。Tvi?Cel5A具有較高的催化活性和熱穩(wěn)定性，具有較大的研究和應(yīng)用潛力。?

T.viride?WL?0422菌株由江南大學(xué)篩選和保藏，該菌株已于2006年在《江蘇食品與發(fā)酵》雜志的No.1?Pg.1公開(kāi)，本發(fā)明人承諾該菌株在20年內(nèi)向公眾發(fā)放。?

本發(fā)明的技術(shù)方案：一種來(lái)源于T.virideWL?0422的第5家族葡聚糖酶基因(Tvi?cel5A)，其cDNA序列為SEQ?ID?NO：1。?

所述的由完整cDNA推導(dǎo)的Tvi?Cel5A氨基酸序列為SEQ?ID?NO：2。?

所述的重組Tvi?Cel5A的活性測(cè)定方法：?

于25mL具塞試管A和B中，各加入用pH?5.0、檸檬酸-磷酸二氫鈉緩沖液配制的質(zhì)量濃度為0.5％的β-葡聚糖(Sigma，USA)溶液2.4mL，50℃預(yù)熱10min，在A管中加入0.1mL適當(dāng)稀釋的酶液，50℃準(zhǔn)確反應(yīng)15min，立即各加入2.5mL?3′，5′一二硝基水楊酸(DNS)試劑，在B管中再補(bǔ)加0.1mL酶液，A和B管均煮沸7min；冷卻后各加去離子水5mL，搖勻；540nm處以B管為空白對(duì)照測(cè)定A管吸光度值，并從葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)的還原糖(以葡萄糖計(jì))含量并折算成酶活性單位。酶活性單位定義：在本測(cè)定條件下，以每分鐘產(chǎn)生1μmol還原糖所需的酶量定義為1個(gè)β-1，4-內(nèi)切葡聚糖酶活性單位(U)。?

所述的Tvi?Cel5A成熟肽基因的克隆和表達(dá)方法：?

(1)Tvi?Cel5A?cDNA序列的克隆：基于綠色木霉Tvi?Cel5A成熟肽基因cDNA序列設(shè)計(jì)兩條引物pPIC9KN和pPIC9KC，擴(kuò)增成熟肽基因：?

pPIC9KN：5′-CCCAAGCTTCTACTTTCTTGCGAGACACGA-3′，含EcoR?I酶切位點(diǎn)?

pPIC9KC：5′-CGGAATTCCAGCAGACTGTCTGG-3′，含Not?I酶切位點(diǎn)?