[發明專利]β-1,4-內切葡聚糖酶(TviCel5A)基因的克隆及表達

無效

• 申請號: 201110410457.6
• 申請日: 2011-12-12
• 公開（公告）號: CN102392034A
• 公開（公告）日: 2012-03-28
• 發明（設計）人: 鄔敏辰;陳忠法;汪俊卿;羅秋玲;龔燕燕
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N15/56
• 分類號: C12N15/56;C12N9/42;C12N15/10;C12N15/81;C12R1/885;C12R1/84
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1.一種來源于T.virideWL?0422的第5家族內切葡聚糖酶基因(Tvi?cel5A)，其mRNA序列對應于序列表中的SEQ?ID?NO：1。

2.由權利要求1所述的β-1，4-內切葡聚糖酶基因(Tvi?cel5A)編碼的β-1，4-內切葡聚糖酶，其氨基酸序列為SEQ?ID?NO：2。

3.綠色木霉WL?0422?Tvi?Cel5A成熟肽cDNA序列的獲取方法：

基于綠色木霉Tvi?Cel5A成熟肽基因cDNA序列設計兩條引物pPIC9KN和pPIC9KC，擴增成熟肽基因：

pPIC9KN：5′-CCCAAGCTTCTACTTTCTTGCGAGACACGA-3′，含EcoR?I酶切位點

pPIC9KC：5′-CGGAATTCCAGCAGACTGTCTGG-3′，含Not?I酶切位點

按照TaKaRa?RNA?PCR?Kit(Ver.3.0)說明書進行RT-PCR；以Oligo?dT-Adaptor?Primer為引物進行反轉錄合成cDNA的第一條鏈；以M13?Primer?M4和pPIC9KN為引物進行第一輪PCR；以pPIC9KN和pPIC9KC為引物進行第二輪PCR；將兩輪PCR產物用1％瓊脂糖凝膠電泳分析，并割膠回收目的條帶。

4.含編碼Tvi?Cel5A成熟肽基因的表達質粒的構建和表達方法：

(1)使用EcoR?I和Not?I對割膠回收的目的基因與pPIC9K分別進行雙酶切，割膠回收的酶切產物在T4?DNA連接酶的作用下進行連接，得到重組質粒pPIC9K-Tvi?cel5A(圖1)，并對重組表達質粒進行序列測定；

(2)用Sal?I對pPIC9K-Tvi?cel5A進行線性化，按照畢赤酵母表達手冊進行電轉、篩選，得到高拷貝的畢赤酵母重組子GS115/Tvi?cel5A；按照手冊上的標準流程進行誘導表達，用DNS法測定重組葡聚糖酶活性；發酵液經冷凍離心、超濾、離子交換層析和凝膠過濾層析，獲得了電泳純的重組β-1，4-內切葡聚糖酶。