[發(fā)明專利]β-1,4-內(nèi)切木聚糖酶(Aor Xyn11A)基因的克隆及重組酶的制備

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110410412.9
• 申請(qǐng)日: 2011-12-12
• 公開（公告）號(hào): CN102392033A
• 公開（公告）日: 2012-03-28
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 鄔敏辰;史紅玲;張慧敏;高樹娟;李劍芳
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 江南大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/56
• 分類號(hào): C12N15/56;C12N9/42;C12N15/10;C12N1/19;C12N15/81;C12R1/69;C12R1/84
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技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及源自米曲霉(Aspergillus?oryzae)CICC?40186菌株的一種糖苷水解酶11家族的木聚糖酶基因序列的克隆，木聚糖酶工程菌的構(gòu)建以及重組木聚糖酶的高效表達(dá)和純化的方法，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。?

背景技術(shù)

纖維素、半纖維素和木質(zhì)素是植物細(xì)胞壁的主要成分，而木聚糖是植物半纖維素的重要組成部分，它是繼纖維素之后含量第二豐富的可再生生物資源。木聚糖酶是降解木聚糖的一組酶的總稱，由于木聚糖的來(lái)源不同，其結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性也不同，它的完全降解需要多種水解酶的參與共同作用完成，如內(nèi)切木聚糖酶、β-D-木糖苷酶、葡糖糖醛酸酶以及α-L-阿拉伯呋喃糖酶等。其中最重要的是β-1，4-內(nèi)切木聚糖酶(endo-β-1，4-xylanase，EC?3.2.1.8)，它能從木聚糖主鏈的內(nèi)部隨機(jī)切割木糖苷鍵，將其降解成寡聚木糖、木二糖和少量木糖，是半纖維素類資源轉(zhuǎn)化和利用不可缺少的生物催化劑。大多數(shù)微生物木聚糖酶都是單亞基蛋白，不同微生物來(lái)源的木聚糖酶等電點(diǎn)各不相同，大多數(shù)β-1，4-內(nèi)切型木聚糖酶的最適pH值為4.0～7.0，pH穩(wěn)定范圍為3.0～10.0；最適反應(yīng)溫度在40℃～75℃之間。通常真菌木聚糖酶比細(xì)菌木聚糖酶的溫度穩(wěn)定性差，而且真菌木聚糖酶的最適pH值更偏酸性。?

木聚糖酶在各方面的應(yīng)用很廣泛，比如在飼料工業(yè)、造紙工業(yè)、生物能源、食品與醫(yī)藥工業(yè)等方面。現(xiàn)在國(guó)內(nèi)外對(duì)木聚糖酶的研究主要集中在兩個(gè)方面，一方面是研究如何提高木聚糖酶的表達(dá)水平，以期在工業(yè)生產(chǎn)中推廣應(yīng)用。另一方面是對(duì)木聚糖酶進(jìn)行基因改造，改善其酶學(xué)性質(zhì)，使之更適合工業(yè)應(yīng)用要求。但就國(guó)內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)或專利報(bào)道來(lái)看，微生物木聚糖酶發(fā)酵酶活性普遍不高，導(dǎo)致了生產(chǎn)成本很高，從而阻礙了該酶在眾多領(lǐng)域中的廣泛應(yīng)用。為了提高木聚糖酶的發(fā)酵產(chǎn)率和酶活性，早期的研究工作主要集中在產(chǎn)酶菌種的篩選、誘變、產(chǎn)酶誘導(dǎo)，酶的分離純化及性質(zhì)，酶水解底物方式及應(yīng)用等方面。進(jìn)入90年代，隨著基因工程技術(shù)和蛋白質(zhì)工程技術(shù)的廣泛應(yīng)用，研究工作逐步轉(zhuǎn)向酶基因的克隆和表達(dá)以及酶活性位點(diǎn)的研究等方面。目前，雖已有一些有關(guān)木聚糖酶基因的克隆和表達(dá)的文獻(xiàn)和專利報(bào)道，但有關(guān)來(lái)源于米曲霉木聚糖酶基因的克隆和表達(dá)等的研究未見有報(bào)道。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種米曲霉(Aspergillus?oryzae)CICC?40186菌株新型木聚糖酶基因序列克隆，木聚糖酶工程菌的構(gòu)建以及重組木聚糖酶的高效表達(dá)和純化的方法。生物信息學(xué)分析表明，來(lái)源于A.oryzae?CICC?40186菌株的一種新型殼聚糖酶屬于糖苷水解酶第11家?族，命名為Aor?Xyn11A，其相應(yīng)的基因命名為Aorxyn11A。Aor?Xyn11A具有較高的催化活性和熱穩(wěn)定性，有較大的工業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用潛力及經(jīng)濟(jì)價(jià)值。?

本發(fā)明的技術(shù)方案：一種源自A.oryzae?CICC?40186菌株新型Aor?Xyn11A基因的核苷酸序列分別為SEQ?ID?NO：1。?

A.oryzae菌株從中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(CICC)購(gòu)買。?

所述的由完整mRNA序列推導(dǎo)的Aor?Xyn11A氨基酸序列為SEQ?ID?NO：2。?

所述的重組Aor?Xyn11A的活性測(cè)定方法：?

于25mL具塞試管A和B中，各加入用pH?4.6、檸檬酸-磷酸二氫鈉緩沖液配制的質(zhì)量濃度為0.5％的樺木木聚糖溶液2.4mL，50℃預(yù)熱10min，在A管中加入0.1mL適當(dāng)稀釋的酶液，50℃準(zhǔn)確反應(yīng)20min；立即各加入2.5mL?3′，5′-二硝基水楊酸(DNS)試劑，在B管中再補(bǔ)加0.1mL酶液，A和B管均煮沸7min；冷卻后各加去離子水5mL，搖勻；540nm處以B管為空白對(duì)照測(cè)定A管吸光度值，并從木糖標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)的還原糖(以木糖計(jì))含量并折算成酶活性單位。酶活性單位定義：在本測(cè)定條件下，以每分鐘產(chǎn)生1μmol還原糖所需的酶量定義為1個(gè)殼聚糖酶活性單位(U)。?

所述的Aorxyn11A完整mRNA序列的克隆和表達(dá)方法：?