[發明專利]β-1,4-內切木聚糖酶(Aor Xyn11A)基因的克隆及重組酶的制備

無效

• 申請號: 201110410412.9
• 申請日: 2011-12-12
• 公開（公告）號: CN102392033A
• 公開（公告）日: 2012-03-28
• 發明（設計）人: 鄔敏辰;史紅玲;張慧敏;高樹娟;李劍芳
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N15/56
• 分類號: C12N15/56;C12N9/42;C12N15/10;C12N1/19;C12N15/81;C12R1/69;C12R1/84
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1.一種來源于米曲霉(Aspergillus?oryzae)CICC?40186菌株糖苷水解酶第11家族(GH11)的新型木聚糖酶基因(Aor?xyn11A)，其核苷酸序列為SEQ?ID?NO：1。

2.由權利要求1所述的殼聚糖酶基因(Aor?xyn11A)編碼的新型殼聚糖酶(Aor?Xyn11A)，其完整的氨基酸序列對應于序列表中的為SEQ?ID?NO：2。

3.Aor?xyn11A基因序列的獲取方法：

(1)Aor?xyn11A?3′端mRNA序列的克隆：首先對Aspergillus?terreus、Aspergillus?clavatus、Aspergillus?fumigatus和Aspergillus?niger的木聚糖酶序列進行同源比對，找出兩段7個氨基酸的保守序列，再對該兩段氨基酸序列的mRNA進行同源比對，設計兩條正向簡并引物XynF1和XynF2；

XynF1：5’-TACTA(C/T)TCCTTCTGGAC(C/T)GA-3’

XynF2：5’-GGCAACTTTGTCGG(C/T)GG(G/A)A-3’

以A.oryzae?CICC?40186總RNA為模板，Oligo?dT-Adaptor?Primer為引物反轉錄合成cDNA的第一條鏈；以M13?Primer?M4和XynF1為引物進行第一輪PCR，其反應條件為：94℃2min，30個循環(94℃30s，53℃30s，72℃90s)，72℃10min；以M13?Primer?M4和XynF1為引物進行第二輪PCR，其反應條件為：94℃2min，30個循環(94℃30s，52℃30s，72℃90s)，72℃10min；目的條帶經克隆、測序，得到Aor?xyn11A?3′端mRNA序列；

(2)Aor?xyn11A?5′端mRNA序列的克隆：基于上述得到的Aor?xyn11A?3′端mRNA序列，設計兩條反向引物XynR1和XynR2；

XynR1：TCCGGAGTAGGTGATTGCTCT

XynR2：CCATCCTTTCCCGCCGACGA

以反轉錄合成的cDNA第一條鏈為模板、Outer?Primer和XynR1為引物進行第一輪PCR，其反應條件為：94℃3min，30個循環(94℃30s，55℃30s，72℃60s)，72℃10min；以InnerPrimer和XynR2為引物進行第二輪PCR，其反應條件為：94℃3min，30個循環(94℃30s，55℃30s，72℃60s)，72℃10min；目的條帶經克隆、測序，得到Aor?xyn11A?5′端mRNA序列；

4.Aor?Xyn11A工程菌的構建和表達方法：

(1)含編碼Aor?Xyn11A成熟肽基因的表達質粒的構建：以M13?Primer?M4和XynF3為引物進行第一輪PCR(94℃2min；30個循環，94℃30s，53℃30s，72℃60s；72℃10min)；以XynF3和XynR3為引物第二輪PCR(94℃2min；30個循環，94℃30s，53℃30s，72℃45s；72℃10min)；將第二輪PCR的目的條帶進行克隆、測序；測序正確的pUCm-T-xyn11A與pPIC9K質粒均用EcoR?I和Not?I進行雙酶切，回收的酶切產物在T4DNA連接酶的作用下進行連接，得到重組質粒pPIC9K-xyn11A，并對重組質粒進行測序鑒定；

(2)GS115/xyn11A的構建、表達、產物純化及活性測定：用Sal?I對pPIC9K-xyn11A進行線性化，按照畢赤酵母表達手冊進行電轉化、篩選，得到高拷貝的畢赤酵母重組子GS115/xyn11A；該工程菌用1.0％甲醇誘導96h，DNS法測得發酵液中重組殼聚糖酶活性達155U/mL。發酵液經離心后的上清液為重組Aor?Xyn11A粗酶液，經截留分子量為10kDa的超濾膜濃縮，再經DEAE-Sepharose?Fast?Flow離子交換層析和Sephadex?G-75凝膠過濾層析純化，純化后經SDS-PAGE檢測為單一條帶，并顯示重組殼聚糖酶分子量為23kDa；該重組殼聚糖酶最適作用溫度50℃，最適作用pH?5.5，該酶在pH?4.5～7.5、40℃以下穩定。