[發明專利]β-1,4-內切木聚糖酶催化域(Aor Xyn10BC)基因的克隆及表達

無效

• 申請號: 201110410397.8
• 申請日: 2011-12-12
• 公開（公告）號: CN102492707A
• 公開（公告）日: 2012-06-13
• 發明（設計）人: 鄔敏辰;殷欣;李劍芳;劉曉彤;羅秋玲
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N15/56
• 分類號: C12N15/56;C12N9/42;C12N15/10;C12N15/81;C12N1/19;C12R1/84
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技術領域

本發明涉及源自米曲霉(Aspergillus?oryzae)CICC?40186菌株的一種新型10家族木聚糖酶催化域(Aor?Xyn10BC)基因完整cDNA序列的克隆及分析，木聚糖酶催化域基因工程菌的構建及重組木聚糖酶的高效表達和純化的方法，屬于生物工程技術領域。?

背景技術

在自然界中植物細胞壁是一個巨大的碳水化合物倉庫，半纖維素約占植物干重的33％，是除纖維素之外最為豐富的多糖。木聚糖是半纖維素最主要的成分之一，廣泛存在于植物細胞的細胞壁和胞間層中。木聚糖結構復雜，其主鏈由以β-1，4-糖苷鍵相連的木糖殘基構成，當主鏈被取代后可形成包含阿拉伯糖、葡糖醛酸、甲基葡糖醛酸、乙酰基、阿魏酰基及p-香豆素等取代基的側鏈。木聚糖的這種復雜的結構導致其完全降解需要眾多酶的共同參與才能完成，其中能夠水解木聚糖主鏈的木聚糖酶在整個水解過程中起最重要的作用。?

內切β-1，4-D-木聚糖酶(β-1，4-D-endoxylanase，EC?3.2.1.8)是木聚糖酶的主要組分之一，它能夠從木聚糖主鏈的內部切割β-1，4糖苷鍵形成寡聚木糖和少量木糖。木聚糖酶在自然界分布很廣，研究較多的是微生物產生的木聚糖酶，已報道能合成木聚糖酶的微生物有細菌、放線菌、真菌和酵母菌等。根據木聚糖酶催化區域的結構和性質分析，可將其分為不同的家族，其中以糖苷水解酶第10家族和第11家族居多。?

目前木聚糖酶已在造紙、食品、能源、飼料以及環境等領域體現出了重要的應用價值，雖然每年都有數目龐大的新的木聚糖酶被發現，但實際上大多數微生物中木聚糖酶的酶學性質和產量都不能滿足工業生產的要求。而隨著基因工程的發展，運用分子生物學方法對木聚糖酶進行改造將加速木聚糖酶在各領域中的應用。?

發明內容

本發明的目的是提供一種新型10家族木聚糖酶催化域cDNA序列的克隆和分析，木聚糖酶催化域基因工程菌的構建及重組木聚糖酶的高效表達和純化的方法，為該基因的異源高效表達和產業化生產奠定理論基礎，也為其他木聚糖酶研究奠定基礎。根據Bernard?Henrissat等提出的糖苷水解酶分類法，絕大多數木聚糖酶屬于糖苷水解酶第10和11家族。生物信息學分析表明該基因所編碼的木聚糖酶屬于A.oryzae?CICC?40186中發現的一種10家族木聚糖酶的催化域，命名為Aor?Xyn10BC，其相應的基因命名為Aor?xyn10BC。?

本發明的技術方案：一種來源于A.oryzae?CICC?40186的新型10家族木聚糖酶催化域基因(Aor?xyn10BC)，其cDNA序列為SEQ?ID?NO：1。?

所述的由cDNA推導的Aor?Xyn10BC氨基酸序列為SEQ?ID?NO：2。?

所述的重組木聚糖酶的活性測定方法：?

于25mL具塞試管A和B中，各加入用pH?4.6、檸檬酸-Na₂HPO₄緩沖液配制的質量濃度為0.5％的樺木木聚糖(Sigma，USA)溶液2.4mL，50℃預熱10min，在A管中加入0.1mL適當稀釋的酶液，50℃準確反應15min；立即各加入2.5mL?3′，5′-二硝基水楊酸(DNS)試劑，在B管中再補加0.1mL酶液，A和B管均煮沸7min；冷卻后各加去離子水5mL，搖勻；540nm處以B管為空白對照測定A管吸光度值，并從木糖標準曲線上查出相應的還原糖(以木糖計)含量并折算成酶活性單位。酶活性單位定義：在本測定條件下，以每分鐘產生1μmol還原糖所需的酶量定義為1個木聚糖酶活性單位(IU)。?

所述的Aor?xyn10BC?cDNA序列的克隆和表達方法：?

(1)Aor?xyn10BC?cDNA序列的克隆：基于我們申請的《β-1，4-內切木聚糖酶(Aor?Xyn10B)基因的克隆及序列分析》及預測的催化域，設計兩條引物Xyn10BC-F1和Xyn10BC-R1：?

Xyn?10BC-F1：5′-GAGCTGGTCTGCATGACGC-3′?

Xyn?10BC-R1：5′-CAAAACCTCCAAAATGCC-3′?