[發明專利]β-1,4-內切木聚糖酶催化域(Aor Xyn10BC)基因的克隆及表達

無效

• 申請號: 201110410397.8
• 申請日: 2011-12-12
• 公開（公告）號: CN102492707A
• 公開（公告）日: 2012-06-13
• 發明（設計）人: 鄔敏辰;殷欣;李劍芳;劉曉彤;羅秋玲
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N15/56
• 分類號: C12N15/56;C12N9/42;C12N15/10;C12N15/81;C12N1/19;C12R1/84
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種源自米曲霉(Aspergillus?oryzae)CICC?40186、歸屬于糖苷水解酶第10家族的新型木聚糖酶催化域基因，其cDNA的核苷酸序列對應于序列表中的SEQ?ID?NO：1。

2.如權利要求1所述的新型木聚糖酶催化域(Aor?Xyn10BC)，其氨基酸序列為SEQ?ID?NO：2。

3.A.oryzae?CICC?40186?Aor?xyn10BC?cDNA序列的獲取方法：

基于我們申請的《β-1，4-內切木聚糖酶(Aor?Xyn10B)基因的克隆及序列分析》及預測的催化域，設計兩條引物Xyn10BC-F1和Xyn10BC-R1：

Xyn10BC-F1：5′-GAGCTGGTCTGCATGACGC-3′

Xyn10BC-R1：5′-CAAAACCTCCAAAATGCC-3′

以A.orvzae?CICC?40186總RNA為模板，Oligo?dT-Adaptor?Primer為引物反轉錄合成cDNA的第一條鏈；以M13?Primer?M4和Xyn10BC-F1為引物進行第一輪PCR(94℃2min；30個循環，94℃30s，51℃30s，72℃90s；72℃10min)；以Xyn10BC-F1和Xyn10BC-R1為引物進行第二輪PCR(94℃2min；30個循環，94℃30s，51℃30s，72℃1min；72℃10min)；目的條帶經克隆、測序得到Aor?xyn10BC?cDNA序列。

4.A.oryzae?CICC?40186木聚糖酶催化域基因工程菌的構建和表達方法：

(1)構建含編碼Aor?Xyn10BC成熟肽基因的表達質粒：基于上述得到的木聚糖酶催化域基因cDNA序列，設計一對引物Xyn10BC-F_o和Xyn10BC-R_o，獲得已去除信號肽基因序列的催化域成熟肽基因：

Xyn10BC-F_o：5′-CTCGAGAAAAGAGCTGGTCTGCATGACGC-3′，含Xho?I酶切位點

Xyn10BC-R_o：5′-GCGGCCGCTTACAAAACCTCCAAAATGCC-3′，含Not?I酶切位點

以合成的cDNA第一條鏈為模板，M13?Primer?M4和Xyn10BC-F_o為引物進行第一輪PCR(94℃2min；30個循環，94℃30s，51℃30s，72℃90s；72℃10min)；以Xyn10BC-F_o和Xyn10BC-R_o為引物第二輪PCR(94℃2min；30個循環，94℃30s，51℃30s，72℃1min；72℃10min)；將第二輪PCR的目的條帶進行克隆、測序；測序正確的pUCm-T-xyn10BC與一種改造后的pPIC9K^M質粒均用Xho?I和Not?I進行雙酶切，回收的酶切產物在T4DNA連接酶的作用下進行連接，得到重組質粒pPIC9K^M-xyn10BC，并對重組質粒進行測序鑒定；

(2)GS115/xyn10BC的構建、表達、產物純化及活性測定：用Sal?I對pPIC9K^M-xyn10BC進行線性化，按照畢赤酵母表達手冊進行電轉化、篩選，得到高拷貝的畢赤酵母重組子GS115/xyn10BC；該工程菌用0.5％甲醇誘導96h，DNS法測得發酵液中重組木聚糖酶活性達20IU/mL；離心上清液為重組木聚糖酶粗酶液，經截留分子量為10kDa的超濾膜濃縮，再經DEAE-Sepharose?Fast?Flow離子交換層析和Sephadex?G-75凝膠過濾層析純化，純化后經SDS-PAGE檢測為單一條帶，并顯示重組木聚糖酶分子量為50kDa。