[發明專利]用于同時檢測燕麥孢囊線蟲和菲利普孢囊線蟲的特異引物序列、探針序列及其方法

無效

• 申請號: 201110408449.8
• 申請日: 2011-12-09
• 公開（公告）號: CN102605048A
• 公開（公告）日: 2012-07-25
• 發明（設計）人: 李洪連;張煜;袁虹霞;孫炳劍;付博
• 申請（專利權）人: 河南農業大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11;G01N21/64
• 代理公司: 鄭州中原專利事務所有限公司 41109
• 代理人: 張紹琳

技術領域

本發明屬于農作物線蟲分子檢測新技術，具體涉及采用TaqMan-MGB探針實時熒光定量檢測燕麥孢囊線蟲和菲利普孢囊線蟲的方法的建立及應用。

背景技術

禾谷孢囊線蟲病(CCN-Heterodera?avenae?group)是一種危害嚴重的全球性禾谷類植物線蟲病害，對世界的禾本科植物尤其是小麥的生產造成了重大危害。禾谷孢囊線蟲是一個復合種群，包括燕麥孢囊線蟲(H.avenae)、菲利普孢囊線蟲(H.filipjevi)、麥類孢囊線蟲(H.1atipons)等10多個種，我國大多數省份報道小麥孢囊線蟲病的病原為燕麥孢囊線蟲，李洪連等(2010)和彭德良等分別在河南許昌、延津等地發現了菲利普孢囊線蟲。

目前，分子生物學技術已廣泛用于孢囊線蟲的種類鑒定工作，現階段多采用ITS-RFLP和ITS-RAPD、ISSR等分子標記方法來區分不同種類的禾谷孢囊線蟲，這些分子標記技術具有多態性高、不影響目標性狀表達等優點，但也有實驗周期長、靈敏度不高等缺點難以克服。實時熒光定量PCR(RT-qPCR)是在PCR技術基礎上發展起來的一種高度靈敏的核酸定量技術，具有簡便快速、靈敏度高、準確性好等特點，此技術不僅能很好的克服常規分子標記技術所具有的缺點，而且可以通過與標準品對照，獲知模板的含量。

發明內容

本發明要解決的技術問題是提供一種同時快速檢測小麥孢囊線蟲的方法，是專門針對小麥兩種重要的病原線蟲：燕麥孢囊線蟲和菲利普孢囊線蟲的快速分子檢測新技術。該方法設計了特異的TaqMan-MGB探針，采用實時熒光定量(RT-qPCR)法，可以特異性檢測燕麥孢囊線蟲和菲利普孢囊線蟲，此方法具有實驗周期短、靈敏度高、準確性高等優點，可用于同時快速準確的檢測小麥的燕麥孢囊線蟲和菲利普孢囊線蟲兩種孢囊線蟲。

本發明的技術方案是：用于同時檢測燕麥孢囊線蟲和菲利普孢囊線蟲的特異引物序列：

燕麥孢囊線蟲和菲利普孢囊線蟲的通用擴增引物序列為：

上游引物P1：5′-GCCGTGATGAGACGACGY-3′；

下游引物P2：5′-AGCCGAGTGATCCACCG-3′。

用于同時檢測燕麥孢囊線蟲和菲利普孢囊線蟲的探針序列：

燕麥孢囊線蟲的探針序列Probe?A為：

FAM-ATGCTTCTGCACGTGGCTTA-MGB，5′端標記報告熒光基團FAM，3′端標記TaqMan-MGB；

菲利普孢囊線蟲的探針序列Probe?F為：

JOE-TCCGTGCTCTGCTTATAGCA-MGB，5′端標記報告熒光基團JOE，3′端標記TaqMan-MGB。

用于同時檢測燕麥孢囊線蟲和菲利普孢囊線蟲的方法，包括提取檢測燕麥孢囊線蟲和菲利普孢囊線蟲的DNA后，按如下實時熒光定量反應體系和反應條件對燕麥孢囊線蟲和菲利普孢囊線蟲進行檢測，所述實時熒光定量反應體系，在20μl體系中加入以下成份：

所述反應程序為：95℃預變性5min；進入循環，95℃變性15s；63℃退火1min，40個循環，檢測熒光信號得出擴增產物的熔解曲線。

本發明的有益效果是：本發明采用實時熒光定量(RT-qPCR)TaqMan-MGB探針法，特異性檢測燕麥孢囊線蟲和菲利普孢囊線蟲，此方法具有實驗周期短、靈敏度高、準確性高等優點，可用于快速準確的檢測禾谷孢囊線蟲。本發明簡便快速：2小時內完成樣品制備和檢測，并且可以同時檢測出燕麥孢囊線蟲和菲利普孢囊線蟲；結果準確：已經成功用于國內多個省份的200多份線蟲樣本檢測；靈敏度高：可以檢測出1/1000個線蟲二齡幼蟲DNA樣品。

附圖說明

圖1為用梯度稀釋的重組質粒進行RT-qPCR的熒光曲線，A1-A5為FAM通道熒光曲線；B1-B5為JOE通道熒光曲線；

圖2為用梯度稀釋的重組質粒進行RT-qPCR的標準曲線(FAM通道)；

圖3為單條線蟲梯度稀釋-FAM通道檢測結果；

圖4為單條線蟲梯度稀釋-JOE通道檢測結果。

具體實施方式

一種同時檢測燕麥孢囊線蟲和菲利普孢囊線蟲的方法，包括燕麥孢囊線蟲和菲利普孢囊線蟲的特異性檢測引物及探針：

表1?燕麥孢囊線蟲和菲利普孢囊線蟲的特異性檢測引物及探針