[發明專利]一種快速準確發現、鑒定及制備蛋白質水解物源抗菌肽的方法

有效

• 申請號: 201110406867.3
• 申請日: 2011-12-09
• 公開（公告）號: CN102533912A
• 公開（公告）日: 2012-07-04
• 發明（設計）人: 張暉;肖建輝;郭曉娜;錢海峰;王立;齊希光
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12P21/06
• 分類號: C12P21/06;C07K1/22;G01N27/62
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技術領域

本發明涉及一種以細胞膜親和色譜結合高效液相指紋圖譜和質譜為技術快速準確發現、鑒定及制備蛋白質水解物源抗菌肽的工藝，屬于生物活性肽的制備純化領域。?

背景技術

由于抗生素濫用導致的殘留嚴重，自然界中微生物的抗藥性不斷增強。在人和動物身上已發現了能抵抗現有抗生素(青霉素、大環內酯類、甲氧芐氨嘧啶.磺胺甲基異噫唑、四環素類、氟奎諾酮、氯霉素、萬古霉素)的耐藥菌株。近二十年來，耐藥菌株的感染也逐年呈上升趨勢，嚴重威脅人類的健康。常規抗生素的抗性增加問題已經成為全球公共衛生問題。因此，尋求廣譜、高效的新一代抗菌藥物已成為世界性的迫切需要。?

抗菌肽發現于二十世紀八十年代，和已有的常規抗生素作用于特異靶蛋白不同的是，抗菌肽以入侵微生物的細胞膜為靶目標，引起細胞膜的裂解從而導致細胞死亡，同時不易使病原菌產生耐藥性。因而，抗菌肽有望成為替代抗生素的新一代抗菌藥物。但是，目前在抗菌肽的生產方面存在以下問題：天然抗菌肽資源有限，且直接提取工藝復雜，成本昂貴；化學合成法成本太高，產業化困難，同時難以保證合成肽類的生物活性；基因工程方法雖然使獲得大量、廉價抗菌肽成為可能，但在實際操作中發現其獲得的抗菌肽抗菌、抗病毒能力弱，導致受體細胞“自殺”而難以用常用的細菌、病毒作表達體系且基因表達產量不高。因此，如何提高抗菌肽的生產效率，降低成本，是應用抗菌肽首要解決的問題。?

細胞膜色譜法(Cell?Membrane?Chromatography，CMC)是研究受體與藥物相互作用的新型親和色譜技術，將高效液相色譜、細胞生物學與受體藥理學相結合，利用藥物與膜受體間存在的特異性親和力，成功地將藥物體內的作用過程在色譜柱內進行動態模擬。?

由于抗菌肽與細菌細胞膜間存在著特異性的親和力，將細胞膜色譜法運用在抗菌肽的制備純化領域，為抗菌肽的分離純化尋找提供一種目的性強、高效、簡便、快捷的方法是可行的。但是，目前在國內外運用細胞膜色譜法分離純化抗菌肽未見相關的文獻報道。?

本專利利用細胞膜親和色譜技術原理，建立大腸桿菌細胞膜固定相色譜萃取模型，同時，結合高效液相指紋圖譜和質譜技術快速篩選蛋白質水解物源抗菌肽。?

發明內容

本發明的目的是提供一種以細胞膜親和色譜結合高效液相指紋圖譜和質譜為技術快速準確發現、鑒定及制備蛋白質水解物源抗菌肽的工藝，包括如下步驟：?

(1)將在固體培養基中活化好的大腸桿菌接入液體培養基中培養至對數期，離心取得菌體，清洗菌體7-10次以去除殘留的培養基。?

(2)將步驟(1)中得到的菌體，在-30℃冰箱中凍存4-7h，取出置于37℃水浴鍋中融解，反復凍融5-9次，低速離心取得菌體。?

(3)將步驟(2)中得到的菌體，用400-800W的超聲波功率進行細胞裂解處理，超聲波每次輻射4-10s，間隔4-10s，總時間40-60min，低速離心取得沉淀，此沉淀為大腸桿菌細胞膜。?

(4)將步驟(3)中得到的細胞膜，放在離心管中，然后加入活化好了的大孔球形硅膠，在4-10℃下反應結合20-90min后，采用3-5μm的微孔濾膜反復過濾5-10次，去除液體，取得固體，此固體為細胞膜親和固定相。?

(5)以麻瘋樹仔粕蛋白為例，利用多種蛋白酶(堿性蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶、酸性蛋白酶、復合蛋白酶、風味蛋白酶和木瓜蛋白酶等)進行酶解，控制料液比1∶8～1∶15混合，在50～60℃下調節pH2.0～9.0，水解得到的不同水解度(7％-15％)的水解物后，調回pH到6.8-7.6，90～100℃水浴滅酶10min，然后對得到的不同水解度的水解物(等溶度1-10mg/ml)進行抗菌測試，取的抗菌能力測試最好的組分并在-20℃下保存。?

(6)將步驟(5)得到的樣品和步驟(3)得到的親和固定相，置于置于1-15ml容量的離心管中，置于1-15ml的離心管中，在10-37℃下孵育萃取20-120min，離心取的上清液。沉淀用緩沖液清洗5-10次，合并清洗液和上清液，并命名為流出液。?

(7)將步驟(5)得到的樣品和步驟(6)得到的流出液，利用高效液相-質譜技術，檢測其指紋圖譜，分析差異峰，純化制備差異峰并進行抗菌能力測試，同時，找出差異峰的肽系列，制備得到的差異峰為蛋白質水解物源抗菌肽。?

本發明方法的優點：?

1、本發明可以以廉價的農副產品和食品工業下腳料為原料，采用蛋白酶水解，大量制備出抗菌肽組分，變廢為寶，減少環境污染，降低生產成本，具有很好的發展前景；?