[發明專利]一種快速準確發現、鑒定及制備蛋白質水解物源抗菌肽的方法

有效

• 申請號: 201110406867.3
• 申請日: 2011-12-09
• 公開（公告）號: CN102533912A
• 公開（公告）日: 2012-07-04
• 發明（設計）人: 張暉;肖建輝;郭曉娜;錢海峰;王立;齊希光
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12P21/06
• 分類號: C12P21/06;C07K1/22;G01N27/62
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1.一種快速準確發現、鑒定及制備蛋白質水解物源抗菌肽的方法，包括如下步驟：

(1)親和細胞膜固定相的制備

(2)蛋白抗菌水解物的制備

(3)親和萃取聯用高效液相及質譜技術準確快速發現及鑒定抗菌肽

2.根據權利要求1所述親和細胞膜固定相的制備，其特征在于：

(1)將在固體培養基中活化好的大腸桿菌接入液體培養基中培養至對數期，離心取得菌體，清洗菌體7-10次以去除殘留的培養基。

(2)將步驟(1)中得到的菌體，在-30℃左右的冰箱中凍存4-7h，取出置于10-37℃水浴鍋中融解，反復凍融5-9次，低速離心取得菌體。

(3)將步驟(2)中得到的菌體，用400-800W的超聲波功率進行細胞裂解處理，超聲波每次輻射4-10s，間隔4-10s，總時間40-60min，低速離心取得沉淀，此沉淀為大腸桿菌細胞膜。

(4)將步驟(3)中得到的細胞膜，放在離心管中，然后加入活化好了的大孔球形硅膠，在4-10℃下反應結合20-90min后，采用3-5μm的微孔濾膜反復過濾5-10次，去除液體，取得固體，此固體為細胞膜親和固定相。

3.根據權利要求1所述蛋白抗菌水解物的制備，其特征在于：

(1)以麻瘋樹仔粕蛋白為例，利用多種蛋白酶進行酶解，控制料液比1∶8～1∶15混合，在50～60℃下調節pH2.0～9.0，水解得到的不同水解度(7％-15％)的水解物后，調回pH到6.8-7.6，90～100℃水浴滅酶10min，然后對得到的不同水解度的水解物(等溶度1-10mg/ml)進行抗菌測試，取的抗菌能力測試最好的組分并在-20℃下保存。

4.根據權利要求1所述親和萃取聯用高效液相及質譜技術準確快速發現及鑒定抗菌肽，其特征在于：

(1)將權利要求2中得到的細胞膜親和固定相和權利要求3中得到的最好的抗菌水解物組分，置于1-15ml的離心管中，在10-37℃下孵育萃取20-120min，離心取的上清液。沉淀用緩沖液清洗5-10次，合并清洗液和上清液，并命名為流出液。

(2)將權利要求3中得到的最好的抗菌水解物組分和步驟(1)得到的流出液，利用高效液相-質譜技術，檢測其指紋圖譜，分析差異峰，純化制備差異峰并進行抗菌能力測試，同時，找出差異峰的肽系列，制備得到的差異峰為蛋白質水解物源抗菌肽。