[發(fā)明專利]嗜熱羧酸酯酶基因工程菌的構(gòu)建及其酶的應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110406844.2
• 申請日: 2011-12-08
• 公開（公告）號: CN102559718A
• 公開（公告）日: 2012-07-11
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 馮雁;鄭翠紅;楊廣宇;白挨璽;李彬春
• 申請（專利權(quán)）人: 上海交通大學(xué)
• 主分類號: C12N15/55
• 分類號: C12N15/55;C12N15/63;C12N1/21;C12N9/18;C12R1/19
• 代理公司: 上海科盛知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 31225
• 代理人: 楊元焱

1.一種嗜熱羧酸酯酶基因工程菌的構(gòu)建，所述的嗜熱羧酸酯酶基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示，其特征在于：包括以下步驟：

A、嗜熱圓錐網(wǎng)團(tuán)菌DSM?6724的培養(yǎng)

按照DSMZ的配方配置厭氧培養(yǎng)基，按照100體積份的厭氧培養(yǎng)基注入1體積份圓錐網(wǎng)團(tuán)菌DSM?6724的比例將圓錐網(wǎng)團(tuán)菌DSM?6724接種到厭氧培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)；

B、基因組DNA的提取

將步驟A培養(yǎng)的嗜熱圓錐網(wǎng)團(tuán)菌DSM?6724用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取嗜熱圓錐網(wǎng)團(tuán)菌DSM?6724的基因組，得到基因組DNA溶液；

C、引物設(shè)計及用PCR法釣取嗜熱羧酸酯酶目的基因

引物設(shè)計如下：

上游引物：5’GATATACCATGGCGCTCCCAGCCCTCTTCTTTCTT?3’，劃線部分為Nco?I的酶切位點；

下游引物：5’CGCCGCGGATCCGGTCTTTTCCTTTGCTCAAATAAC3’，劃線部分為BamH?I的酶切位點；

以步驟B所得基因組DNA溶液為模板，在上述上游引物和下游引物的參與下進(jìn)行PCR反應(yīng)，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，再對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化，得到純化的PCR產(chǎn)物，然后用限制性內(nèi)切酶Nco?I和BamH?I進(jìn)行雙酶切，得到含有粘性末端的嗜熱羧酸酯酶目的基因；

D、構(gòu)建重組表達(dá)載體

以pET28a為載體，對載體用限制性內(nèi)切酶Nco?I和BamH?I進(jìn)行雙酶切，然后用連接試劑盒與步驟C所得含有粘性末端的嗜熱羧酸酯酶目的基因進(jìn)行連接，得到重組表達(dá)載體；

E、將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞中

將步驟D所得重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BLP感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行培養(yǎng)，得到嗜熱羧酸酯酶基因工程菌。

2.如權(quán)利要求1所述的嗜熱羧酸酯酶基因工程菌的構(gòu)建，其特征在于：所述的PCR反應(yīng)的反應(yīng)體系按以下方法配制：DNA聚合酶(Primer?star)1μl，DNA聚合酶緩沖液(Primer?star?buffer)20μl，作為模板的基因組DNA溶液2μl，2.5mM脫氧核苷酸混合物(dNTP)8μl，上下游引物各加40pmol，加超純水至總體積100μl；所述的PCR反應(yīng)的反應(yīng)程序為：94℃預(yù)變性3min；然后98℃變性15s，退火10s，72℃延伸90s，再72℃延伸20min，共30個循環(huán)；然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增時設(shè)置5個退火溫度梯度，分別是50.2℃、52.5℃、56.2℃、60.2℃和63.5℃。

3.如權(quán)利要求1所述的嗜熱羧酸酯酶基因工程菌的構(gòu)建，其特征在于：步驟C所述的用限制性內(nèi)切酶Nco?I和BamH?I進(jìn)行雙酶切的酶切體系包括：40μl純化的PCR產(chǎn)物，上游引物和下游引物各2μl，限制性內(nèi)切酶緩沖液(FD?buffer)4.9μl。

4.如權(quán)利要求2所述的嗜熱羧酸酯酶基因工程菌的構(gòu)建，其特征在于：所述的脫氧核苷酸混合物是脫氧腺嘌呤苷酸、脫氧鳥嘌呤苷酸、脫氧胞嘧啶核苷酸和脫氧胸腺嘧啶核苷酸的混合物。

5.如權(quán)利要求1所述的嗜熱羧酸酯酶基因工程菌的構(gòu)建，其特征在于：步驟D所述的用限制性內(nèi)切酶Nco?I和BamH?I進(jìn)行雙酶切的酶切體系包括：pET28a空載體45μl，上游引物和下游引物各2μl，限制性內(nèi)切酶緩沖液(FD?buffer)6μl，加超純水5μl至總體積60μl。