[發明專利]嗜熱羧酸酯酶基因工程菌的構建及其酶的應用

有效

• 申請號: 201110406844.2
• 申請日: 2011-12-08
• 公開（公告）號: CN102559718A
• 公開（公告）日: 2012-07-11
• 發明（設計）人: 馮雁;鄭翠紅;楊廣宇;白挨璽;李彬春
• 申請（專利權）人: 上海交通大學
• 主分類號: C12N15/55
• 分類號: C12N15/55;C12N15/63;C12N1/21;C12N9/18;C12R1/19
• 代理公司: 上海科盛知識產權代理有限公司 31225
• 代理人: 楊元焱

技術領域

本發明涉及生物技術，具體涉及一種嗜熱羧酸酯酶基因工程菌的構建、利用該工程菌制備的嗜熱羧酸酯酶及該酶在工業中的應用。?

背景技術

嗜熱酶(thermophilic?enzyme，55-80℃)由于在高溫下仍然具有很好的催化活性及熱穩定性，所以與常溫酶和中溫酶相比在工業中有更廣泛的應用。最早開發的嗜熱酶是1969年從美國黃石國家森林公園火山溫泉中分離的一種水生棲熱菌(Thermusaquaticus)yT1株分離提取的Taq?DNA聚合酶，圓錐網團菌DSM6724(Dictyoglomus?turgidum?DSM6724)是一種嗜熱細菌，能在70～75℃生長。從此，嗜熱酶開始引起人們的重視，開始成為研究的焦點，許多具有水解酶活性的嗜熱酶相繼得到開發，并在許多領域發揮了重要作用。今年來，從來源于海底熱流及溫泉的嗜熱細菌和古菌中分離出很多嗜熱酶和超嗜熱酶(hyperthermophilic?enzyme，80-113℃)，為現在分子酶學技術展現了新的應用前景(王柏婧等，微生物學報，2002，42：259-262；Fujiware?S，et?al.J.Biosci.Bioeng.2002，94(6)：518-525；蔡錦剛等，Appl?Microbiol?Biotechnol(2011)89：1463-1473)。?

嗜熱酶作為生物催化劑，與常溫酶及中溫酶相比有很多優點：(1)酶制劑制備的成本低。因為嗜熱酶一般有很好的熱穩定性，可以在室溫下分離提純和包裝運輸，并且能長久地保持活力；(2)動力學反應快。反應溫度的升高可以加快分子運動速度，加快催化反應；(3)減少了能耗。高溫反應對反應器冷卻系統的要求標準降低；(4)提高了產物的純度。在高于70℃的催化溫度下，很少有雜菌生存，從而減少了細菌代謝物對最終產物的污染。嗜熱酶由于其很好的高溫反應活性，近年來已經在食品釀造工業、醫藥工業、環境保護、遺傳工程等領域得到應用，其良好前景備受關注。?

酯解的酶主要分為兩大類：羧酸酯酶(carboxylesterase，EC?3.1.1.1，羧酸酯水?解酶)，是指能夠催化水解羧酸酯生成羧酸和醇的非特異性酯類，在結構上與脂肪酶均屬于α/β水解酶家族，，在氨基酸序列上按絲氨酸-天冬氨酸-組氨酸(Ser-Asp-His)排列，稱為SAH三聯體結構，絲氨酸(Ser)、天冬氨酸(Asp)、組氨酸(His)構成了典型的酶的活性區域。另一類是脂肪酶(EC?3.1.1.3，三酰基甘油水解酶)，催化三酰基甘油的水解。它們在動物，植物，微生物中廣泛存在。?

微生物羧酸酯酶作為重要的工業酶類，可以催化酯水解、酯合成、酯交換等具有重要應用價值的反應，并具有良好的區域選擇性和立體選擇性。由于在食品工業，生物去污劑，醫藥和親酯化學來源酶的生產方面有多樣的應用，羧酸酯酶在生物技術領域扮演著極其重要的角色。?

來源于嗜熱微生物的熱穩定的酶類由于遺傳的穩定性和高溫下催化的高效性，使它們有很好的潛在商業應用價值，已越來越受到關注。嗜熱菌來源的羧酸酯酶由于在高溫和有機溶劑中很好的穩定性，不僅可以延長酯酶的使用時間，還能擴大其應用范圍，已成為生物技術應用領域關注的焦點。總之，羧酸酯酶表現出很好的區域和立體選擇性，其催化反應不需要輔因子，有很好的有機溶劑穩定性和激活作用，這使它成為化學合成和食品加工過程中很好的生物催化劑。一般的羧酸酯酶穩定性差、易失活，與理想的生物催化劑有很大差距，這樣嗜熱酶就表現出很多的優勢。最近博恩朔伊爾(Bornscheuer)和耶格(Jaeger)等總結了羧酸酯酶和脂肪酶的性質和應用。?

因此，開發在高溫環境下具有較高催化活力的羧酸酯酶應用于工業領域，有很好的前景和價值，也有利于研究羧酸酯酶的催化機制。?

發明內容

本發明的目的之一是在嗜熱細菌中提取一種嗜熱羧酸酯酶的基因；?

本發明的目的之二是利用上述嗜熱羧酸酯酶基因通過生物化學及分子生物學技術構建一種嗜熱羧酸酯酶基因工程菌；?

本發明的目的之三是利用上述嗜熱羧酸酯酶基因工程菌制備一種熱穩定性好、催化效率高的嗜熱羧酸酯酶；?

本發明的目的之四是通過對嗜熱羧酸酯酶的理化性質的研究，提供嗜熱羧酸酯酶在工業生產中的多種用途。?