[發明專利]制備人干擾素β1a的細胞的培養方法和培養基及其應用

有效

• 申請號: 201110406364.6
• 申請日: 2011-12-08
• 公開（公告）號: CN102533658A
• 公開（公告）日: 2012-07-04
• 發明（設計）人: 王軍;張慧娟;王妍;朱安穩;黃志斌
• 申請（專利權）人: 深圳新鵬生物工程有限公司;深圳職業技術學院
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12R1/91
• 代理公司: 深圳市博銳專利事務所 44275
• 代理人: 張明

技術領域

本發明涉及生物醫藥領域，具體涉及一種制備人干擾素β1a的細胞培養方法和細胞培養基及細胞培養基的應用。

背景技術

人干擾素β(IFN-β)是具有抗病毒、抗腫瘤、免疫調節作用的重要細胞因子，主要由成纖維細胞和某些上皮細胞產生，普通的干擾素誘生劑，例如病毒、雙鏈RNA和一些微生物均能夠誘導IFN-β的產生。自然IFN-β是一種糖蛋白(糖分約占20％)，相對分子質量約20000，由166個氨基酸組成，有21個氨基酸組成的信號肽，在S-M之間切開。在分子的第17位、31位、141位為Cys，在31位和141位之間形成的二硫鍵對其生物學活性的發揮是必需的。hIFN-β基因長777bp，位于染色體9p22，與IFN-α基因簇鄰近。人白細胞干擾素與成纖維細胞干擾素之間在核苷酸水平上有45％的同源性，在氨基酸水平上有29％的同源性。IFN-α與IFN-β基因均無內含子。IFN-α與IFN-β結合于同一受體，但后者與受體的親和力大于前者。

美國FDA已于1993批準IFN-β1b(大腸桿菌表達)和1996年批準IFN-β1a(CHO細胞表達)用于治療多發性硬化癥(MS)。目前，IFN-β是能夠控制MS反復發作的唯一藥物。據估計，我國MS患者至少有數十萬人，迄今尚無特效藥。CHO細胞與大腸桿菌表達的IFN-β1a相比，具有較高的抗病毒比活性，較小的副作用以及較長的半衰期。

中國倉鼠卵巢細胞-CHO細胞(Chinese?hamster?ovary?cell)目前被廣泛用于生產各種基因工程蛋白產品。適合用于CHO細胞培養的培養基，根據它的來源及成分的明確程度來劃分，其發展大致可分為三個階段：即天然培養基階段(直接采用某些組織凝塊、生物性液體和組織提取液等作為細胞的培養基)，合成培養基階段(如MEM，DMEM，RPMI1640，F12等)和無血清培養基階段。合成培養基通常需在其中添加一些諸如血清<常用的如小牛血清、胎牛血清等，一般在5-15％)等天然的體液性補充物才能較長時間地維持細胞生長。血清的主要作用在于向細胞提供激素(生化因子)、轉移蛋白和其它營養物質等。但即使采用低血清培養，還是不能忽視血清帶來的問題(如在培養過程中貼壁，不適用于大規模培養)。無血清培養基的優勢很大程度上體現在避免了血清的缺點，此外它還具有血清培養難以比擬的優點，如保存和應用方便；使用該種培養基制備的產品易于純化，提高回收率；成分明確，有利于研究細胞的生理調節機制；可根據不同細胞株設計和優化出適合其高密度生長或高水平目的產物表達的培養基等。因此，近年來許多科研工作者致力于開發無血清培養基。

目前國內干擾素β1a研究較少，產干擾素IFN-β1a(CHO細胞表達)的培養基配方效率較低，亟需開發一種適合工業化生產，成本低，產量高的產重組人干擾素β1a的細胞培養基和培養方法。

發明內容

本發明的目的是提供一種產人干擾素β1a的細胞的培養方法和細胞培養基及培養基的應用，從而得到一種適合工業化生產，活性高，產量高的產干擾素β1a細胞培養方法。

本發明的技術方案為提供一種制備人干擾素β1a的細胞的培養基，其組分包括基礎培養基和添加物，所述基礎培養基的濃度為12-18g/L、所述基礎培養基為CHO-S-SFM?II培養基或SFM4CHO培養基，所述添加物為D-半乳糖：0.05-0.45g/L、D-甘露糖：0.3-0.7g/L、N-乙酰氨基葡萄糖：0.10-0.50g/L、D-葡萄糖：1.0-5.0g/L。

優選的上述培養基中，所述添加物還包括正丁酸鈉、磷酸二氫鉀、氯化鈉中的一種或幾種。

優選的上述培養基中，所述基礎培養基為SFM培養基，所述SFM培養基為CHO-S-SFM?II培養基或SFM4CHO培養基。

優選的上述培養基中，包括以下濃度的各組分：基礎培養基：12-18g/L、D-半乳糖：0.05-0.45g/L、D-甘露糖：0.3-0.7g/L、N-乙酰氨基葡萄糖：0.10-0.50g/L、D-葡萄糖：1.0-5.0g/L、正丁酸鈉：0.05-1mM、磷酸二氫鉀：0.5-3.5mM、氯化鈉：10-60mM。

優選的上述培養基中，包括以下濃度的各組分：基礎培養基：12-18g/L、D-半乳糖：0.05g/L、D-甘露糖：0.3g/L、N-乙酰氨基葡萄糖：0.3g/L、D-葡萄糖：5g/L、正丁酸鈉：0.5mM、磷酸二氫鉀：0.5mM、氯化鈉：20mM。

本發明的另一個方案為提供一種制備人干擾素β1a的細胞培養方法，包括以下步驟