[發明專利]制備人干擾素β1a的細胞的培養方法和培養基及其應用

有效

• 申請號: 201110406364.6
• 申請日: 2011-12-08
• 公開（公告）號: CN102533658A
• 公開（公告）日: 2012-07-04
• 發明（設計）人: 王軍;張慧娟;王妍;朱安穩;黃志斌
• 申請（專利權）人: 深圳新鵬生物工程有限公司;深圳職業技術學院
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12R1/91
• 代理公司: 深圳市博銳專利事務所 44275
• 代理人: 張明

1.制備人干擾素β1a的細胞的培養基，其特征在于，其組分包括基礎培養基和添加物，所述基礎培養基的濃度為12-18g/L，所述添加物為D-半乳糖：0.05-0.45g/L、D-甘露糖：0.3-0.7g/L、N-乙酰氨基葡萄糖：0.10-0.50g/L、D-葡萄糖：1.0-5.0g/L。

2.按權利要求1所述的制備人干擾素β1a的細胞的培養基，其特征在于，所述添加物還包括正丁酸鈉、磷酸二氫鉀、氯化鈉中的一種或幾種。

3.按權利要求1所述的制備人干擾素β1a的細胞的培養基，其特征在于，所述基礎培養基為SFM培養基，所述SFM培養基為CHO-S-SFM?II培養基或SFM4CHO培養基。

4.按權利要求1所述的制備人干擾素β1a的細胞的培養基，其特征在于，包括以下濃度的各組分：基礎培養基：12-18g/L、D-半乳糖：0.05-0.45g/L、D-甘露糖：0.3-0.7g/L、N-乙酰氨基葡萄糖：0.10-0.50g/L、D-葡萄糖：1.0-5.0g/L、正丁酸鈉：0.05-1mM、磷酸二氫鉀：0.5-3.5mM、氯化鈉：10-60mM。

5.按權利要求1所述的制備人干擾素β1a的細胞的培養基，其特征在于，包括以下濃度的各組分：基礎培養基：15g/L、D-半乳糖：0.05g/L、D-甘露糖：0.3g/L、N-乙酰氨基葡萄糖：0.3g/L、D-葡萄糖：5g/L、正丁酸鈉：0.5mM、磷酸二氫鉀：0.5mM、氯化鈉：20mM。

6.制備人干擾素β1a的細胞的培養方法，其特征在于，包括以下步驟：

a、取攜帶有表達人干擾素β1a表達基因質粒的細胞凍存管復蘇，傳代培養，轉瓶培養；

b、按0.2×10⁶-2×10⁶cells/ml接種量接入步驟a轉瓶消化下來的細胞，設置起始條件37℃、pH6.8-7.8、溶氧大于20％、轉速40rpm進行細胞罐培養，每天轉速增加10rpm，最終加至120rpm，采用含血清培養基培養5-10天，在灌流速度大于0.2-0.8L/h時，瞬間排空含血清培養基更換權利要求1至4所述的制備人干擾素β1a的細胞培養基，調整培養溫度為34-36℃，根據檢測的葡萄糖濃度調整無血清培養基灌流速度，控制糖濃度在0.3-2.0g/L之間，無血清培養基灌流培養時間約在30-50天左右；

c、灌流培養至灌流速度小于0.05-0.2L/h，連續檢測3次葡萄糖濃度變化不大，均維持在2.0-3.0g/L之間某個數值恒定，檢測細胞收集液生物學活性小于0.5×10⁵IU/ml-0.5×10⁶IU/ml時，判斷為細胞培養終點，結束培養。

7.按權利要求6所述的制備人干擾素β1a的細胞的培養方法，其特征在于，包括以下步驟：

a、取攜帶有表達人干擾素β1a表達基因質粒的中國倉鼠卵巢細胞凍存管復蘇，通過25cm²、75cm²、175cm²方瓶傳代培養15天，傳代5-7代，3L轉瓶培養7-12天，獲得種子細胞量5.0×10⁷-1×10⁹cells；

b、5L細胞罐培養：按0.2×10⁶-2×10⁶cells/ml接種量接入步驟a轉瓶消化下來的細胞，設置起始條件37℃、pH6.8-7.8、溶氧大于20％、轉速40rpm進行培養，以后每天轉速增加10rpm，最終加至120rpm。采用含含血清培養基培養5-10天，所述含血清培養基為含10％的新生牛血清，90％高糖DMEM培養基，灌流速度大于0.2-0.8L/h時，瞬間排空含血清培養基更換權利要求1至4所述的制備人干擾素β1a的細胞培養基，調整培養溫度為34-36℃，根據檢測的葡萄糖濃度調整無血清培養基灌流速度，控制糖濃度在0.3-2.0g/L之間，無血清培養基灌流培養時間約在30-50天左右；

c、灌流培養至灌流速度小于0.05-0.2L/h，連續檢測3次葡萄糖濃度變化不大，均維持在2.0-3.0g/L之間某個數值恒定，檢測細胞收集液生物學活性小于0.5×10⁵IU/ml-0.5×10⁶IU/ml時，判斷為細胞培養終點，結束培養。

8.權利要求1-4制備人干擾素β1a的細胞的培養基的用途，在含表達人干擾素β1a表達基因質粒的細胞培養中的應用。