[發明專利]快速定量檢測蚊子組織中沃爾巴克氏體（Wolbachia）的引物及其試劑盒和方法

有效

• 申請號: 201110404916.X
• 申請日: 2011-12-07
• 公開（公告）號: CN102382898A
• 公開（公告）日: 2012-03-21
• 發明（設計）人: 奚志勇;朱儉
• 申請（專利權）人: 廣州沃巴克生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11;C12R1/01
• 代理公司: 廣州科粵專利商標代理有限公司 44001
• 代理人: 劉明星;莫瑤江

技術領域：

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種快速定量檢測蚊子體內組織中沃爾巴克氏體(Wolbachia)的引物及其試劑盒和方法。

背景技術：

沃爾巴克氏體(Wolbachia)是廣泛分布于節肢動物體內的共生微生物，它可能是昆蟲共生微生物中最為豐富的類群。它分布于鞘翅目、雙翅目、半翅目、同翅目、膜翅目、鱗翅目等昆蟲種類中。它以垂直傳播作為其在宿主世代間傳遞的基本模式。它穩定地存在于宿主的生殖細胞內，通過卵細胞傳遞給宿主子代，并可通過多種方式如細胞質不親和、雌性化和殺雄性等調控宿主的生殖活動。通過這些調控作用促進其在宿主種群內廣泛傳播。

在沃爾巴克氏體(Wolbachia)引起的宿主生殖行為改變中，細胞質不親和(Cytoplasmic?Incompatibility，CI)是最常見的一種類型。它表現為當被沃爾巴克氏體(Wolbachia)感染的雄蚊與未感染雌蚊或感染不同種類Wolbachia的雌雄蚊交配時，精子和卵子結合后胚胎無法發育。沃爾巴克氏體(Wolbachia)的胞質不親和的特性可導致Wolbachia感染的蚊能侵入未感染或感染不同種Wolbachia的蚊群進行種群壓制和種群替代。它的應用對蚊媒病防治具有巨大的價值。近期研究發現，沃爾巴克氏體(Wolbachia)不僅具有上述的特性外，同時它還能在蚊子體內與蚊子攜帶的一些重要的病原生物(如登革病毒，瘧原蟲等)相互作用，抑制它們在蚊子體內的增值和擴散從而在阻斷這些病原生物傳播于人類。沃爾巴克氏體(Wolbachia)的這種抑制作用與它在蚊子體內組織的分布相關，所以，了解沃爾巴克氏體(Wolbachia)在蚊子體內組織分布有助于快速篩選出傳播阻斷效果最好的沃爾巴克氏體(Wolbachia)感染的蚊子，也有助于監測沃爾巴克氏體(Wolbachia)在蚊群中的垂直傳播，同時也有利于高效率地監測大規模大地域范圍的沃爾巴克氏體(Wolbachia)在蚊子組織中的感染情況。

目前，在蚊子體內組織中檢測沃爾巴克氏體(Wolbachia)的方法以采用針對沃爾巴克氏體(Wolbachia)表面蛋白的抗體進行Western-blotting來檢測。此方法需要有沃爾巴克氏體(Wolbachia)表面蛋白的抗體，這種抗體還沒有商業化，需要實驗室自己制備。制備抗體不僅耗費也耗時，一般制備特異性不高的抗體(多克隆抗體)最少需要2-3月，若要制備特異性高的抗體(單克隆抗體)需要時間更長。同時，這種檢測條件限制很強，不能同時檢測多樣品，因而不能進行大批量檢測。另外，此方法最大的缺點在于它不能對沃爾巴克氏體(Wolbachia)進行定量分析。

發明內容：

本發明的第一個目的是提供一種快速定量檢測蚊子體內組織中沃爾巴克氏體(Wolbachia)的Real-time?PCR引物。

本發明首先分離獲取含有沃爾巴克氏體(Wolbachia)的不同組織，提取沃爾巴克氏體(Wolbachia)基因組DNA；采用沃爾巴克氏體(Wolbachia)特異性的PCR引物對沃爾巴克氏體(Wolbachia)DNA進行Real-time?PCR檢測，從而實現本發明的目的。

本發明的快速定量檢測蚊子體內組織中沃爾巴克氏體(Wolbachia)的Real-time?PCR引物，其特征在于，包括根據蚊子的看家基因設計的引物作為內參引物和根據沃爾巴克氏體(Wolbachia)的特異性基因設計的引物作為檢測引物。

所述的蚊子的看家基因優選為核糖體S6蛋白(rpS6)基因，所述的沃爾巴克氏體(Wolbachia)的特異性基因優選為表面蛋白(WSP)基因。

優選，所述的根據核糖體S6蛋白(rpS6)基因設計的引物作為內參引物，當蚊子為埃及伊蚊時，其引物序列為：RPS6-RTF：CGTCGTCAGGAACGTATCCG和RPS6-RTR：TCTTGGCAGCCTTAGCAGC；或當蚊子為斯氏按蚊(Anopheles?stephensi)時，其引物序列為Asr?ps6-RTF：ACGACCACAAGCTGCGTCAC，Asrps6-RTR：GTCAGCACACCCTGCTTCATG；所述的根據沃爾巴克氏體(Wolbachia)的表面蛋白(WSP)基因設計的引物作為檢測引物，其引物序列為Wb-RTF：ACATTTGCTCCAACAACTG和Wb-RTR：AACTGCACTAGCTTCTG。