[發明專利]一種人羊膜間充質干細胞的分離純化及鑒定方法

無效

• 申請號: 201110404587.9
• 申請日: 2011-12-08
• 公開（公告）號: CN102559586A
• 公開（公告）日: 2012-07-11
• 發明（設計）人: 方寧;陳代雄
• 申請（專利權）人: 遵義醫學院附屬醫院
• 主分類號: C12N5/0735
• 分類號: C12N5/0735;G01N33/53;G01N15/10
• 代理公司: 貴陽中新專利商標事務所 52100
• 代理人: 吳無懼

技術領域

本發明屬于生物技術領域，涉及一種人羊膜間充質干細胞的分離、純化及鑒定方法。

背景技術

人羊膜間充質干細胞（human?amniotic?mesenchymal?stem?cells,?hAMSCs）發源于胚胎早期的胚外中胚層，具有與骨髓間充質干細胞相似的表型，如表達SSEA-4、?OCT-4、CD29、CD44、CD73、CD90、CD166及波形蛋白，而不表達CD34、CD45、CD80、CD86及HLA-DR；具有多系分化潛能，在適宜誘導條件下可分化成肝細胞、骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞心肌細胞、、胰島細胞、神經元樣細胞等；具有來源廣泛，取材方便、無侵入性傷害、不牽涉醫學倫理問題等優勢，因此，hAMSCs作為供體細胞資源在再生醫學領域具有廣泛的應用前景。此外，MSCs還具有免疫調節作用，在器官移植、血液系統疾病和自身免疫性疾病的臨床治療領域顯現出優于傳統治療的獨特價值。

hAMSCs的制備過程涉及hAMSCs的分離、純化、鑒定、體外培養擴增等技術環節。目前關于hAMSCs的分離、純化、鑒定尚無統一方案。hAMSCs的分離方法有胰蛋白酶-膠原酶液化、膠原酶-中性蛋白酶、羊膜片貼壁培養分離等方法，酶消化法相對簡便，而貼壁培養分離較為煩瑣且收率不高。各家在采用胰蛋白酶-膠原酶液化法分離hAMSCs時所用胰蛋白酶和膠原酶的濃度、消化溫度、消化時間等條件各不相同，分離效果（收率）存在較大差異，迄今尚無具有統計學意義的每份人羊膜的hAMSCs收率數據。hAMSCs的純化方法多采用原始分離樣品貼壁培養。hAMSCs的鑒定主要根據其表型特征通過高能量流式細胞術、免疫組織化學染色、免疫熒光檢測hAMCs標志物，如CD14、CD29、CD34、CD44、、CD45?、CD90、HLA-DR、SSEA-4?、OCT-4等；少數采用逆轉錄—聚合酶鏈反應（RT-PCR）檢測其相關基因及全能性相關基因表達，如LEFTYA、Cripto、Sox2、Nanog、Oct-4、ACTG2、ACTA2?、MMP2等。目前不僅缺乏統一的?hAMSCs鑒定標準，而且存在諸多問題：①受檢樣品不一致，原代和傳代細胞的表型標志不盡相同；②hAMCs與羊膜上皮細胞的陽性標志物有交叉，如CD44、?CD90?、SSEA-4?、OCT-4等，陰性標志物也有交叉如CD14、CD34、?CD45、?HLA-DR等，單憑這些標志物的檢測不能區分hAMCs與羊膜上皮細胞；③有的檢測方法如原位免疫組織化學染色和免疫熒光染色不能反映細胞群體的標志特征，有的檢測方法如PCR較為繁瑣且成本較高。

鑒于上述存在的問題，本發明提供了一種人羊膜間充質干細胞的分離、純化及鑒定方法，是一種高豐度、高純度、高活力的分離方法、簡便而明確的鑒定指標和適宜的體外擴增培養方案。

發明內容

本發明解決的技術問題是：現有技術存在的問題，本發明提供了一種高收率、高純度、高活力的人羊膜間充質干細胞分離、純化方法以及簡便、準確的人羊膜間充質干細胞鑒定方法。

本發明采用的技術方案為：?

本發明的人羊膜間充質干細胞的分離，包括以下步驟：

第一，無菌采集人足月剖宮產胎盤，機械法將羊膜從胎盤組織上剝離，用D-Hank’?s液沖洗數次以清除殘留血跡，將羊膜剪成碎片；

第二，羊膜碎片加入含EDTA的胰蛋白酶消化溶液旋轉消化10分鐘，棄上清；重新加入消化液，旋轉消化棄上清，留取未消化的羊膜碎片；

第三，D-Hank’s液沖洗未消化的羊膜碎片，加入含有DNase?I的膠原酶，旋轉消化至組織完全消化，300目鋼網過濾，收集細胞濾液，離心，收集細胞沉淀，得到原始的人羊膜間充質干細胞；

第四，將分離的原始的人羊膜間充質干細胞重新懸浮于LG-DMEM培養基（購自Gibco公司，貨號：31600-026）中，將細胞密度接種于6孔培養板，置于CO₂培養箱培養，在倒置顯微鏡下除去完全未貼壁生長的羊膜上皮細胞，第3天更換新的培養基；待細胞匯合度達80~90%后，用胰蛋白酶—EDTA溶液消化，加入培養基終止胰蛋白酶作用，離心棄上清，細胞沉淀用培養基重新懸浮，以1×10⁷/L的細胞密度傳代。

本發明的人羊膜間充質干細胞的鑒定方法，包括以下步驟：