[發(fā)明專利]一種人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞的分離純化及鑒定方法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110404587.9
• 申請(qǐng)日: 2011-12-08
• 公開（公告）號(hào): CN102559586A
• 公開（公告）日: 2012-07-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 方寧;陳代雄
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院
• 主分類號(hào): C12N5/0735
• 分類號(hào): C12N5/0735;G01N33/53;G01N15/10
• 代理公司: 貴陽(yáng)中新專利商標(biāo)事務(wù)所 52100
• 代理人: 吳無懼

1.一種人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞的分離純化方法，其特征在于：包括以下步驟：

第一，無菌采集人足月剖宮產(chǎn)胎盤，機(jī)械法將羊膜從胎盤組織上剝離，用D-Hank’?s液沖洗數(shù)次以清除殘留血跡，將羊膜剪成碎片；

第二，羊膜碎片加入含0.02%EDTA的0.05%胰蛋白酶消化溶液，于37°C，旋轉(zhuǎn)消化棄上清；重新加入消化液，于37°C旋轉(zhuǎn)消化棄上清，留取未消化的羊膜碎片；

第三，D-Hank’s液沖洗未消化的羊膜碎片，加入含有0.075?mg/ml?DNase?I的0.75?mg/ml的膠原酶，于37°C，旋轉(zhuǎn)消化約2?h至組織完全消化，300目鋼網(wǎng)過濾，收集細(xì)胞濾液，離心得到原始的人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞；

第四，將分離的原始的人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞重新懸浮于LG-DMEM培養(yǎng)基中，將細(xì)胞密度接種于6孔培養(yǎng)板，置于CO₂培養(yǎng)箱培養(yǎng)，在倒置顯微鏡下除去完全未貼壁生長(zhǎng)的羊膜上皮細(xì)胞，第3天更換新的培養(yǎng)基；待細(xì)胞匯合度達(dá)80~90%后，用胰蛋白酶—EDTA溶液消化，加入培養(yǎng)基終止胰蛋白酶作用，離心棄上清，細(xì)胞沉淀用培養(yǎng)基重新懸浮，以1×10⁷/L的細(xì)胞密度傳代。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞的分離純化方法得到的人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞的鑒定方法，其特征在于：包括以下步驟：

第一，免疫細(xì)胞化學(xué)染色：人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞爬片用PBS?緩沖液漂洗，多聚甲醛固定，PBS漂洗，Triton-X100作用15~20?min，H₂O₂滅活內(nèi)源性過氧化物酶，PBS漂洗，加正常羊血清封閉，滴加波形蛋白抗體或鼠抗人CK19抗體室溫孵育，PBS漂洗，滴加鼠兔通用型二抗室溫孵育，PBS漂洗，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，中性樹膠封固，光學(xué)顯微鏡下觀察，陰性對(duì)照組用PBS替代一抗；

第二，流式細(xì)胞術(shù)分析?：調(diào)整人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞密度為1×10⁶/ml，每管200???L細(xì)胞懸液，共3管，分別加入各20??L熒光標(biāo)記單抗CD29-PE+CD44-FITC、CD34-PE+CD45-FITC和CD166-PE，混勻，室溫避光孵育，每管加2?ml含1?g/L?NaN₃的磷酸鹽緩沖液，混勻，離心棄上清，振蕩懸浮細(xì)胞，每管加入10?g/L多聚甲醛300???L，混勻，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，用Cell?Quest軟件進(jìn)行采集分析，用小鼠IgG-FITC或IgG-PE作為同型對(duì)照。