[發明專利]變異葡萄糖脫氫酶有效

申請號：	201110404251.2	申請日：	2011-10-27
公開（公告）號：	CN102453702A	公開（公告）日：	2012-05-16
發明（設計）人：	早出廣司;小島勝博	申請（專利權）人：	愛科來株式會社;生物工程實驗室有限責任公司
主分類號：	C12N9/04	分類號：	C12N9/04;C12N15/53;C12N1/15;C12N1/19;C12N1/21;C12Q1/54;C12Q1/32;C12Q1/02
代理公司：	北京東方億思知識產權代理有限責任公司 11258	代理人：	李劍
地址：	日本***	國省代碼：	日本;JP
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摘要：
搜索關鍵詞：	變異葡萄糖脫氫酶
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【說明書】：

技術領域

本發明涉及底物特異性提高的變異葡萄糖脫氫酶。具體而言，本發明涉及包含下述變異型α亞單位的葡萄糖脫氫酶及其基因，所述變異型α亞單位是在構成包含細胞色素C的葡萄糖脫氫酶(下文中也稱為CyGDH)的α亞單位氨基酸殘基中引入變異的。本發明的葡萄糖脫氫酶可以適用于葡萄糖傳感器及葡萄糖檢測試劑盒等，在生物化學領域、臨床領域等中有用。

背景技術

目前，野生型的CyGDH及以吡咯并喹啉苯醌為輔酶的PQQGDH用于血糖自測傳感器。野生型的CyGDH及PQQGDH有如下缺點：由于其不僅與葡萄糖反應而且還與麥芽糖反應，因此在患者的血中麥芽糖濃度高的情況下，不能測定準確的血糖值。特別是在日本和英國，使用麥芽糖作為輸液中的能量物質，實際上，利用腹膜透析等施用輸液的低血糖患者，還會發生因用PQQGDH型的血糖傳感器而被誤認為高血糖的事故。

野生型CyGDH對麥芽糖的反應性比對葡萄糖的反應性高，在葡萄糖濃度為50mg/dL時，麥芽糖濃度為100mg/dL時的血糖值測量結果顯示出170％的高值。

鑒于如上所述的情況，發明了CyGDH的變異體酶(在α亞單位的氨基酸殘基的326位和365位上引入變異，分別取代成谷氨酰胺(Q)、酪氨酸(Y)的變異葡萄糖脫氫酶(以下也可稱為CyGDH(QY)或者簡稱為QY、QYA))(國際公開號2006/137283)，在葡萄糖濃度為50mg/dL時，麥芽糖濃度為100mg/dL時的血糖值測量結果能夠被控制到36％的高值。但是，還不能說是規避麥芽糖影響的效果徹底的物質。

發明內容

本發明的課題在于，提供與CyGDH(QY)相比對葡萄糖的底物特異性提高的CyGDH。

本發明人為了解決上述課題進行了潛心研究，結果發現，通過分別用谷氨酰胺及酪氨酸取代構成CyGDH的α亞單位的氨基酸殘基中相應于326位和365位的位點，并且進一步用酪氨酸取代相應于472位的位點，與CyGDH(QY)相比，底物特異性進一步提高，而且，即使將GDH的同源物中的相應于326位、365位及472位的位點分別用谷氨酰胺、酪氨酸及酪氨酸取代也可帶來同樣的效果，從而完成了本發明。

即，本發明為以下的內容。

(1)變異葡萄糖脫氫酶，其具有和序列號3有至少80％的同一性的氨基酸序列，并且具有葡萄糖脫氫酶活性，其特征在于：

所述氨基酸序列的相應于326位、365位及472位的氨基酸殘基分別被谷氨酰胺、酪氨酸及酪氨酸取代；

對葡萄糖的底物特異性提高，對二糖類的反應性降低。

(2)如(1)所述的變異葡萄糖脫氫酶，其具有和序列號3有至少90％的同一性的氨基酸序列。

(3)如(1)或(2)所述的變異葡萄糖脫氫酶，其中，相應于于326位、365位及472位的位置以外具有序列號3所示的氨基酸序列。

(4)如(1)或(2)所述的變異葡萄糖脫氫酶，其中，相應于326位、365位及472位的位置以外具有序列號7所示的氨基酸序列。

(5)如(1)或(2)所述的變異葡萄糖脫氫酶，其中，相應于326位、365位及472位的位置以外具有序列號8所示的氨基酸序列。

(6)如(1)或(2)所述的變異葡萄糖脫氫酶，其中，相應于326位、365位及472位的位置以外具有序列號9所示的氨基酸序列。

(7)如(1)或(2)所述的變異葡萄糖脫氫酶，其中，相應于326位、365位及472位的位置以外具有序列號10所示的氨基酸序列。

(8)如(1)～(7)中任一項所述的變異葡萄糖脫氫酶，其特征在于，與所述氨基酸序列中相應于326位和365位的氨基酸殘基分別被谷氨酰胺及酪氨酸取代但472位未被取代的葡萄糖脫氫酶相比較，對葡萄糖的底物特異性提高，對二糖類的反應性降低。

(9)如(1)～(8)中任一項所述的變異葡萄糖脫氫酶，其特征在于，二糖類為麥芽糖。