[發明專利]一種重組腺病毒的制備方法及其用途

無效

• 申請號: 201110404142.0
• 申請日: 2011-12-02
• 公開（公告）號: CN102492723A
• 公開（公告）日: 2012-06-13
• 發明（設計）人: 孫勇;朱云
• 申請（專利權）人: 孫勇
• 主分類號: C12N15/867
• 分類號: C12N15/867;C12N15/66;A61K48/00;A61P1/00
• 代理公司: 徐州市三聯專利事務所 32220
• 代理人: 何君

技術領域

本發明涉及一種重組腺病毒，具體地說是涉及一種重組腺病毒的制備方法及其用途，該重組腺病毒包含hITF全長基因序列，屬生物醫學技術領域。

背景技術

嚴重燒傷不僅可導致大面積的皮膚及皮下組織損毀，各臟器也都存在不同程度的損害，其中胃腸道損害尤為嚴重，腸道已被視為“燒(創)傷應激的中心器官之一”。燒傷后胃腸粘膜屏障功能受損是引發腸源性感染、腸源性高代高、全身炎癥反應綜合癥(SIRS)，乃至多器官功能障礙(MODS)的重要原因。因此，如何減輕嚴重燒傷后胃腸粘膜損傷，加速胃腸粘膜修復是目前燒傷救治中的重要問題。腸三葉因子(intestinal?trefoil?factor，ITF)是由腸杯狀細胞特異分泌的小分子多肽，它的59個氨基酸序列中有一段特殊的核心結構域，其間的6個半胱氨酸按特定(1-5，2-4和3-6)的順序，依次以二硫鍵兩兩相接，形成3個環狀結構，整個肽鏈由此發生彎曲和折疊，形如“三葉草”，故名腸三葉因子(ITF)。ITF一經發現便受到廣大學者的廣泛關注，大量的研究表明，ITF在腸粘膜的自我保護及修復機制中占據重要地位。作為一個具有廣泛應用前景的藥物前體，卻因為復雜的制備過程、較低的產量限制了它的應用。基因治療是近年來出現的嶄新的治療手段，是將人正常基因或有治療作用的基因通過一定方式導入人體靶細胞以糾正基因的缺陷或者發揮治療作用，從而達到治療疾病目的的生物醫學高技術。若通過基因治療的途徑將ITF基因導入體內，可以使ITF在體內大量表達，有望簡化繁瑣的操作程序、降低昂貴的生產成本。腺病毒作為目前使用最為廣泛的基因傳遞載體，具有眾多優點：宿主范圍廣、安全、滴度高、多基因表達、穩定、外源基因容量大、可高水平介導外源基因表達、可感染增殖和非增殖細胞、與人類基因同源性以及免疫途徑簡便。經檢索，目前國內外尚未發現關于構建包含hITF基因的腺病毒載體的報道。

發明內容

本發明的目的在于克服上述現有技術的不足之處，提供一種重組腺病毒的制備方法及其用途，該重組腺病毒為包含hITF全長基因序列的腺病毒，將hITF基因與穿梭質粒(pAdTrack-CMV)相連接，構建重組穿梭質粒pAdTrack-CMV-hITF；再將重組穿梭質粒線性化后與骨架質粒pAdEasy-1在大腸桿菌BJ5183中同源重組，構建重組腺病毒載體Ad-hITF；該重組腺病毒可以高效感染腸上皮細胞，表達出分泌型hITF，顯著地促進腸上皮細胞遷移，作為藥物對胃腸粘膜損傷具有治療作用。

本發明是以如下技術方案實現的：一種重組腺病毒的制備方法，它包含人腸三葉因子基因(hITF)的腺病毒，其特征是：將hITF基因與穿梭質粒(pAdTrack-CMV)相連接，構建重組穿梭質粒pAdTrack-CMV-hITF；再將重組穿梭質粒線性化后與骨架質粒pAdEasy-1在大腸桿菌BJ5183中同源重組，構建重組腺病毒載體Ad-hITF。

所述的一種重組腺病毒的制備方法，其特征是：包括如下步驟：

(1)hITF基因的獲得：腸粘膜組織中總RNA的提取以及引物的設計；

(2)重組穿梭質粒的構建：含有hITF的信號肽與成熟肽序列，與腺病毒穿梭質粒pAdTrack-CMV具有相同的內切酶位點BglII、Not?I，經相同的兩種內切酶酶切后，兩種質粒分別產生互補的粘性末端，在T4DNA連接酶的作用下，目的基因hITF與腺病毒穿梭質粒pAdTrack-CMV相連；

(3)重組穿梭質粒與骨架質粒同源重組：線性化的重組穿梭質粒加入到BJ5183感受態細菌，37℃過夜培養，挑陽性克隆搖菌、提質粒，Pac?I酶切鑒定；

(4)重組腺病毒的包裝：脂質體介導pAd-hITF質粒轉染HEK293細胞，腺病毒的收集與擴增以及腺病毒的滴度測定(TCID50法)；

所述的重組腺病毒可以高效感染腸上皮細胞，表達出分泌型hITF，顯著地促進腸上皮細胞遷移，作為藥物對胃腸粘膜損傷具有治療作用。

所述的重組腺病毒在燒傷小鼠基因治療胃腸粘膜損傷中的應用，首先制備30％TBSA?III°燒傷小鼠模型；重組腺病毒灌胃，觀察治療作用。

本發明的優點是：傳統的hITF治療方法為，通過基因重組技術在體外制備hITF，其制備過程復雜、純化手段繁瑣、保存條件嚴格，且產量低下；本發明通過制備含有hITF基因的重組腺病毒，口服該腺病毒后hITF可以在胃腸道內源源不斷的產生，無需制備、純化及保存hITF，而且產量高。

附圖說明

圖1為RT-PCR產物電泳圖；

圖2為重組質粒酶切鑒定示意圖：