[發明專利]一種重組腺病毒的制備方法及其用途

無效

• 申請號: 201110404142.0
• 申請日: 2011-12-02
• 公開（公告）號: CN102492723A
• 公開（公告）日: 2012-06-13
• 發明（設計）人: 孫勇;朱云
• 申請（專利權）人: 孫勇
• 主分類號: C12N15/867
• 分類號: C12N15/867;C12N15/66;A61K48/00;A61P1/00
• 代理公司: 徐州市三聯專利事務所 32220
• 代理人: 何君

1.一種重組腺病毒的制備方法，它包含人腸三葉因子基因(hITF)的腺病毒，其特征是：將hITF基因與穿梭質粒(pAdTrack-CMV)相連接，構建重組穿梭質粒pAdTrack-CMV-hITF；再將重組穿梭質粒線性化后與骨架質粒pAdEasy-1在大腸桿菌BJ5183中同源重組，構建重組腺病毒載體Ad-hITF。

2.根據權利要求1所述的一種重組腺病毒的制備方法，其特征是：包括如下步驟：

(1)hITF基因的獲得：腸粘膜組織中總RNA的提取以及引物的設計；

(2)重組穿梭質粒的構建：含有hITF的信號肽與成熟肽序列，與腺病毒穿梭質粒pAdTrack-CMV具有相同的內切酶位點BglII、Not?I，經相同的兩種內切酶酶切后，兩種質粒分別產生互補的粘性末端，在T4DNA連接酶的作用下，目的基因hITF與腺病毒穿梭質粒pAdTrack-CMV相連；

(3)重組穿梭質粒與骨架質粒同源重組：線性化的重組穿梭質粒加入到BJ5183感受態細菌，37℃過夜培養，挑陽性克隆搖菌、提質粒，Pac?I酶切鑒定；

(4)重組腺病毒的包裝：脂質體介導pAd-hITF質粒轉染HEK293細胞，腺病毒的收集與擴增以及腺病毒的滴度測定(TCID50法)；

3.一種重組腺病毒的用途，其特征是：所述的重組腺病毒可以高效感染腸上皮細胞，表達出分泌型hITF，顯著地促進腸上皮細胞遷移，作為藥物對胃腸粘膜損傷具有治療作用。

4.根據權利要求3所述的一種重組腺病毒的用途，其特征是：所述的重組腺病毒在燒傷小鼠基因治療胃腸粘膜損傷中的應用，首先制備30％TBSA?III°燒傷小鼠模型；重組腺病毒灌胃，觀察治療作用。