[發(fā)明專利]一種利用流式細胞術(shù)檢測細胞胞內(nèi)蛋白的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110403838.1
• 申請日: 2011-12-07
• 公開（公告）號: CN102520188A
• 公開（公告）日: 2012-06-27
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 施維;于洋;朱廣山;李全順;曹秉振
• 申請（專利權(quán)）人: 吉林大學
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68
• 代理公司: 長春吉大專利代理有限責任公司 22201
• 代理人: 張景林;劉喜生

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于流式細胞術(shù)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種利用流式細胞術(shù)檢測細胞胞內(nèi)蛋白的方法。

背景技術(shù)

惡性腫瘤也稱為癌癥，是目前威脅人類生命和健康的主要疾病之一。癌癥的發(fā)病率呈逐年上升趨勢，尤其是70年代以后，癌癥發(fā)病數(shù)以年均3％～5％的速度遞增，不僅如此，癌癥的發(fā)病年齡還趨于年輕化，已成為人類第二大死因。為此，醫(yī)學界一直努力探尋對其進行有效的診治。經(jīng)過半個多世紀的發(fā)展和完善，外科手術(shù)、放療、化療等方法已經(jīng)成為惡性腫瘤綜合治療的主要手段，但在臨床應用時常常引起嚴重的毒副作用，其治療效果并不是很好，治愈率通常較低。大量臨床事實證明，癌變初期的治愈率是相當高的。因此，治療癌癥的關(guān)鍵在于有效的早期診治。目前診斷惡性腫瘤最有效的手段是病理診斷，但準確性往往受限于操作醫(yī)生的工作經(jīng)驗，早期病變?nèi)菀茁┰\、誤診。X線、B超、CT、NMRI是臨床常用的檢測診斷技術(shù)，但是也都存在分辨率不夠高的缺點。尋找方便、快捷、準確的癌癥早期診斷方法意義重大，所以研究更先進的手段或者儀器來實現(xiàn)準確、及時的癌癥早期診斷一直是人們努力的方向，也是廣大醫(yī)藥工作者研究的熱門課題。

納米材料是指在三維空間中至少有一維處于納米尺度范圍(0.1～100nm)或由它們作為基本單元構(gòu)成的具有特殊性能的材料。納米材料自從被發(fā)現(xiàn)和合成以來就一直是人們關(guān)注的熱點。由于其自身具備一些特殊性質(zhì)為生物醫(yī)學的研究提供了良好的平臺，因此在最新的研究中，納米材料在生物醫(yī)學領(lǐng)域中的應用備受矚目。納米技術(shù)是研究納米材料性質(zhì)和應用的一門技術(shù)。目前科研人員通過該技術(shù)制成了藥物、基因、生物大分子等載體，稱之為納米載體。納米載體是一種新型、高效、穩(wěn)定、特異性強的靶向載體，主要應用于生物醫(yī)藥領(lǐng)域。納米載體具有多種形態(tài)：納米微球(納米粒)、納米管、納米片以及納米多邊形等。其中，納米微球(納米粒)是一種應用較為廣泛的納米載體。由于腫瘤所特有的病理生理變化，在腫瘤的診斷治療中，納米技術(shù)能更好地檢測疾病所導致的分子和細胞改變。近年來，研發(fā)的納米載體多用于癌癥的靶向治療，如靶向藥物的運載，而在早期診斷方面的研發(fā)甚少，這也是目前相關(guān)生物技術(shù)領(lǐng)域中的研究前沿。

流式細胞術(shù)是借助流式細胞儀通過抗原抗體反應和熒光標記法完成對細胞各種特性進行定性定量的一種分析技術(shù)。自1977年Horan首次利用流式細胞儀將納米高分子微球應用于免疫學檢測以來，以納米微球作為載體的生物檢測技術(shù)已經(jīng)滲透到細胞生物學、分子生物學、免疫學、醫(yī)學等各個領(lǐng)域。由于流式細胞儀具有可根據(jù)微球粒徑及所帶特征熒光信號對微球進行特異性識別的能力，因此可利用納米微球結(jié)合流式細胞術(shù)建立特異分子的檢測技術(shù)。

近年來，研究人員發(fā)現(xiàn)量子點納米粒具有生物發(fā)光特性，可以此作為標記載體，應用流式細胞術(shù)檢測腫瘤，但是該方法只能檢測出細胞表面特異性分子。二氧化硅納米粒是極其重要的高科技超微細無機新材料之一，因其粒徑很小、微孔多、比表面積大、表面吸附力強、分散性能好、穩(wěn)定性佳等方面具有特異的性能，在眾多學科及領(lǐng)域內(nèi)獨具特性，是一種具有廣泛應用前景的無機納米粒子。為此，本發(fā)明選用二氧化硅納米粒子結(jié)合流式細胞術(shù)建立腫瘤相關(guān)胞內(nèi)蛋白的檢測方法。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種利用流式細胞術(shù)檢測細胞胞內(nèi)蛋白的方法，尤其是檢測與腫瘤相關(guān)的胞內(nèi)蛋白的方法，其包括如下步驟：

1.二氧化硅納米粒的制備

(1)表面氨基化二氧化硅納米粒的制備：

先采用法制備粒徑為100～120nm的二氧化硅納米粒，然后用γ-氨基丙基三乙氧基硅烷對二氧化硅納米粒進行了表面修飾，得到表面氨基化的二氧化硅納米粒；

(2)表面羧基化二氧化硅納米粒的制備：

先采用法制備粒徑為100～120nm的二氧化硅納米粒，然后用硅烷偶聯(lián)劑和丁二酸酐對二氧化硅納米粒表面進行羧基化改性，得到表面羧基化的二氧化硅納米粒；

2.具有結(jié)合胞內(nèi)蛋白特異性二氧化硅納米粒的制備：

(1)具有結(jié)合胞內(nèi)蛋白特異性的表面氨基化二氧化硅納米粒的制備：首先用質(zhì)量分數(shù)為25％的戊二醛溶液活化步驟1中制備的100～120nm表面氨基化的二氧化硅納米粒，再將活化后的納米粒經(jīng)磷酸鹽緩沖液(PBS，NaCl?0.8g，KCl0.02g，Na₂HPO₄·12H₂O?2.9g，KH₂PO₄?0.02g，H₂O?100ml，pH?8.0)清洗后重懸于PBS(pH?8.0)中形成2.5mg/ml的納米粒懸液；