[發明專利]一種利用流式細胞術檢測細胞胞內蛋白的方法

有效

• 申請號: 201110403838.1
• 申請日: 2011-12-07
• 公開（公告）號: CN102520188A
• 公開（公告）日: 2012-06-27
• 發明（設計）人: 施維;于洋;朱廣山;李全順;曹秉振
• 申請（專利權）人: 吉林大學
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68
• 代理公司: 長春吉大專利代理有限責任公司 22201
• 代理人: 張景林;劉喜生

1.一種利用流式細胞術檢測細胞胞內蛋白的方法，其步驟如下：

(1)制備粒徑為100～120nm的表面氨基化或表面羧基化的二氧化硅納米粒；

(2)具有結合胞內蛋白特異性二氧化硅納米粒的制備

(a)具有結合胞內蛋白特異性的表面氨基化二氧化硅納米粒的制備：首先用質量分數為25％的戊二醛溶液活化步驟(1)中制備的100～120nm表面氨基化的二氧化硅納米粒，再將活化后的納米粒經磷酸鹽緩沖液清洗后重懸于磷酸鹽緩沖液中形成2.5mg/ml的納米粒懸液；

然后將上述納米粒懸液與來源于小鼠的抗胞內蛋白的特異性抗體溶液混合，再在4℃輕輕攪拌過夜，真空凍干后得到具有結合蛋白特異性的表面氨基化二氧化硅納米粒，其中納米粒懸液與抗體溶液的體積比為2～5∶1；

(b)具有結合胞內蛋白特異性的表面羧基化二氧化硅納米粒的制備：首先將步驟(1)制備的100～120nm表面羧基化的二氧化硅納米粒用磷酸鹽緩沖液重懸形成濃度為2.5mg/ml的懸液，之后用1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二胺鹽酸鹽和N-羥基琥珀酰亞胺對納米粒進行活化；

然后再將活化后的納米粒懸液與來源于小鼠的抗胞內蛋白的特異性抗體溶液混合，再在4℃輕輕攪拌2h，真空凍干后得到具有結合胞內蛋白特異性的表面羧基化二氧化硅納米粒，其中活化后的納米粒懸液與抗體溶液的體積比為2～5∶1；

(3)腫瘤細胞胞內總蛋白的提取：將體外培養的人腫瘤細胞通過超聲破碎裂解法獲得腫瘤細胞胞內總蛋白溶液，濃度為100～200μg/ml；

(4)與腫瘤細胞胞內總蛋白的結合：將具有結合胞內蛋白特異性的二氧化硅納米粒與獲得的細胞胞內總蛋白溶液混合，用量比例為1mg∶200～400μl，4℃孵育30～60min，然后用磷酸鹽緩沖液清洗2～3次，最后4℃、12000rpm離心5～10min得到與腫瘤細胞胞內總蛋白結合的納米粒子；

(5)在步驟(4)中加入與步驟(2)中等濃度和體積的來源于兔的抗同一胞內蛋白的特異性抗體溶液混合，在4℃孵育30～60min；然后用磷酸鹽緩沖液清洗2～3次，最后用磷酸鹽緩沖液重懸該反應后的納米粒，使其濃度為5mg/ml；

(6)在步驟(5)中加入熒光素標記的二抗溶液，其中加入的熒光素標記的二抗溶液與步驟(5)中反應后納米粒懸液的體積比為1∶200～500，4℃避光孵育30～60min；然后用磷酸鹽緩沖液清洗2～3次，之后用磷酸鹽緩沖液重懸該反應后的納米粒，使其終濃度約為1×10⁵個/ml，從而制備得到“二氧化硅納米粒-抗體(鼠源)-腫瘤細胞胞內蛋白-抗體(兔源)-熒光素標記二抗”的實驗組復合物；

(7)以1mg/ml牛血清白蛋白溶液替代步驟3中的腫瘤細胞胞內總蛋白，重復步驟(2)～(6)，從而制備“二氧化硅納米粒子-抗體(鼠源)-牛血清白蛋白-抗體(兔源)-熒光素標記二抗”作為對照組復合物；

(8)利用流式細胞術對步驟(6)制備的“二氧化硅納米粒-抗體(鼠源)-腫瘤細胞胞內蛋白-抗體(兔源)-熒光素標記二抗”復合物及步驟(7)制備的對照組復合物進行檢測，從而實現對腫瘤細胞特異性胞內蛋白的定性檢測。

2.如權利要求1所述的一種利用流式細胞術檢測細胞胞內蛋白的方法，其特征在于：表面氨基化二氧化硅納米粒的制備是采用法制備粒徑為100～120nm的二氧化硅納米粒，然后用γ-氨基丙基三乙氧基硅烷對二氧化硅納米粒進行了表面修飾，得到表面氨基化的二氧化硅納米粒。

3.如權利要求1所述的一種利用流式細胞術檢測細胞胞內蛋白的方法，其特征在于：表面羧基化二氧化硅納米粒的制備是采用法制備粒徑為100～120nm的二氧化硅納米粒，然后用硅烷偶聯劑和丁二酸酐對二氧化硅納米粒表面進行羧基化改性，得到表面羧基化的二氧化硅納米粒。

4.如權利要求1所述的一種利用流式細胞術檢測細胞胞內蛋白的方法，其特征在于：來源于小鼠的抗胞內蛋白的特異性抗體溶液為β-actin、Akt2或p-Akt1/2/3抗體的磷酸鹽緩沖液溶液，抗體∶磷酸鹽緩沖液的體積比為1∶200～1000。

5.如權利要求1所述的一種利用流式細胞術檢測細胞胞內蛋白的方法，其特征在于：來源于兔的抗胞內蛋白的特異性抗體溶液為β-actin、Akt2或p-Akt1/2/3抗體的磷酸鹽緩沖液溶液，抗體∶磷酸鹽緩沖液的體積比為1∶200～1000。