[發明專利]一種梨果實內韌皮部同化物卸載路徑的熒光示蹤方法

有效

• 申請號: 201110402781.3
• 申請日: 2011-12-07
• 公開（公告）號: CN102495037A
• 公開（公告）日: 2012-06-13
• 發明（設計）人: 張紹鈴;張虎平;黃文江;秦改花;吳俊;陶書田;齊開杰
• 申請（專利權）人: 南京農業大學
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64
• 代理公司: 南京天華專利代理有限責任公司 32218
• 代理人: 徐冬濤;李曉峰

技術領域

本發明涉及一種梨果實內韌皮部同化物卸載路徑的熒光示蹤方法。是利用熒光染料5(6)羧基熒光素酯(CFDA)快速標記梨果實發育過程中來自源葉的光合產物在庫器官內的卸載路徑，屬于植物細胞生理學的領域。

背景技術

梨是世界及中國主栽果樹之一，也是我國出口創匯的傳統果品，在我國除海南省之外的省(市、區)均有梨樹栽培，并且是許多省份(如河北、江蘇、安徽等)的重要水果之一，已經成為我國很多地方農村經濟發展的支柱產業。據中國統計年鑒，截至2010年底，我國梨樹栽培總面積有110.5萬hm²，總產量1426.3萬t，分別占世界梨總栽培面積和總產量的62％和64％以上，是世界上第一大產梨國家。

果實是梨樹的經濟‘庫’器官，果實品質的優劣直接關系到梨產業能否在市場競爭中獲得長足發展。來自源葉的光合產物以山梨醇和蔗糖的形態經韌皮部運輸進入果實貯藏或進一步利用，不僅成為果實品質和其他營養成分及芳香物質合成的基礎原料，而且可作為重要的信號分子參與果實發育相關基因的表達及整個植物源-庫活性的調節，這一觀點已被大家認同。高等植物中的物質運輸主要在維管束中進行，而韌皮部則是其中負責同化物在體內運輸的主要組織。庫器官內的韌皮部同化物卸載的路徑主要有共質體途徑(symplastic)和質外體途徑(apoplastic)。共質體途徑是通過胞間連絲進行的，質外體途徑則是跨膜運動，需要特異的載體介導和能量驅動。目前普遍認為，卸載路徑在很大程度上決定了同化物從‘源’到‘庫’的一系列轉運過程，對卸出效率有著關鍵性的調控作用，最終影響到果實的品質。揭示果實發育過程中同化物卸載的路徑，對于促進果實內糖的積累和轉化，實現優質高產具有重要的理論意義和實踐價值，越來越受到人們的重視。

梨果實中有發達的維管組織系統，除側生心皮束外，其他主要維管束均位于薄壁組織內，這些維管束的分支遍及整個果肉，形成一種網結狀系統，源源不斷地為果實的生長發育提供必需的物質。長期以來，由于研究條件的限制，嚴重制約了人們對梨果實發育過程中韌皮部同化物卸載路徑的認識。近年來，5(6)羧基熒光素酯(CFDA)作為一種比較理想的熒光示蹤物質被用于不同類型庫器官中同化物的卸載路徑研究，通過放射自顯影技術證明其運輸方式同同化物的卸載方式相類似。其原理是：當CFDA被裝載到細胞里，就會被內源酯酶分解成為有熒光信號的5(6)羧基熒光素(CF)，變成了膜不透性的共質體同化物卸載的熒光指示劑。通過在熒光顯微鏡下觀察CF在庫器官內的分布情況，就可以了解韌皮部同化物卸載的路徑，比傳統的顯微放射自顯影技術更安全、更簡單。

但是，我們以梨果實為研究材料時發現，在CFDA標記過程中，若通過其他作物上采用的電流注射法、壓力注射法和顯微注射法則需要專門的設備且技術要求高，而Eppendorf管棉線漸滲法和葉片涂抹法雖然不需要專門的設備，但操作過程繁瑣、容易傷及木質部和韌皮部，且熒光染料溶液蒸發，都達不到理想的標記效果。為此，我們通過實驗建立了一種更為有效的、可快速示蹤梨果實韌皮部同化物卸載路徑的熒光標記方法，獲得了理想的結果，具有重要的實踐應用價值。

發明內容

本發明的目的在于提供一種梨果實內韌皮部同化物卸載路徑的熒光示蹤方法，應用該方法可快速了解梨果實發育過程中來自源葉的光合產物在庫器官內卸出的路徑，具有操作簡單、方便實用及結果理想等優點。

本發明的目的可以通過以下技術方案實現：

一種梨果實內韌皮部同化物卸載路徑的熒光示蹤方法，包括以下步驟：

(1)配制1～2mg/mL熒光染料5(6)羧基熒光素酯(5(6)-carboxyfluoresein?diacetate，CFDA)溶液；

(2)步驟(1)配制的CFDA溶液的引入：輕輕磨擦果柄表皮，不要傷及木質部→迅速將棉花團纏繞在果柄上→用封口膜將棉花團封好→采用微量注射器將配制好的CFDA溶液緩慢注入棉花，每個果實注入150～250μl上述配制好的CFDA溶液→立即用封口膜密封針孔防止溶液外滲→然后用錫箔紙將果柄部位覆蓋好，防止CFDA見光分解；

(3)采樣：經CFDA溶液處理48～72h后采摘果實；

(4)制備切片：將新鮮的經CFDA溶液處理過的果實，切取帶有維管束的果肉組織塊，然后切片，每完成一個切片用載玻片直接沾取切片，使切片平鋪于載玻片的中央；

(5)觀察拍照：制備好的切片，立即用熒光顯微鏡觀察5(6)羧基熒光素(carboxyfluoresein，CF)在果實內的分布圖像，防止熒光淬滅。