[發明專利]水產品中金黃色葡萄球菌的雙重PCR-DHPLC檢測方法

有效

• 申請號: 201110402451.4
• 申請日: 2011-12-07
• 公開（公告）號: CN102399897A
• 公開（公告）日: 2012-04-04
• 發明（設計）人: 周向陽;萬婧;沈飚;胡興娟;邵宏宏;張靜;顏建波
• 申請（專利權）人: 中華人民共和國舟山出入境檢驗檢疫局
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/14;G01N30/02;C12R1/445
• 代理公司: 寧波誠源專利事務所有限公司 33102
• 代理人: 袁忠衛;景豐強

技術領域

本發明涉及一種金黃色葡萄球菌檢測方法。

背景技術

金黃色葡萄球菌是一類重要的食源性致病菌，廣泛存在于空氣、土壤、水以及人和動物的體表黏膜等。據美國CDC報告，金葡菌引起的食物中毒僅次于大腸埃希菌，已居第2位，占細菌性食物中毒的33％，而由金葡菌污染引起的食物中毒事件在我國也是高頻多發。顯而易見，金葡菌的污染已成為世界性的公共衛生問題。因而，建立特異靈敏、快速便捷的檢測技術已成為有效控制食品中金葡菌污染與傳播的關鍵所在。

金葡菌能產生多種毒素，如腸毒素、表皮剝脫毒素、殺白細胞素和毒性休克綜合征毒素等，其中腸毒素是引起金葡菌食物中毒的主要原因。該毒素一旦侵入人體，即使無活的金葡菌存在，也會引起人類惡心、嘔吐等嚴重的食物中毒，而且該腸毒素在100℃條件下經過30min熱處理仍能保持致病性。金葡菌可產生A、B、C、D、E等多種腸毒素，以A型腸毒素引起的食物中毒事件最多，其毒力也最強。鑒于金葡菌對食品安全的高度危害性，各國對人工養殖及海捕水產品均有嚴格的限量要求，多規定為不得檢出或小于50個/克。然而，該菌超標問題時常困擾著出口水產加工企業，成為制約企業發展和經濟效益提高的一大障礙，也使其成為檢驗檢疫部門重點監控的項目之一。

水產品中金葡菌的傳統檢測方法包括增菌、生化鑒定、血清學鑒定等，不僅檢測周期長、操作繁瑣，而且不宜做大批量樣本的檢測，在水產養殖環境監測等其他需大批量檢測的方面，傳統的檢測方法暴露出其種種弊端。隨著分子生物學的發展，PCR技術的產生使得食品中金葡菌的快速檢測達到了一個新的高度。金葡菌的耐熱核酸酶基因已被證實具有非常好的種屬特異性，以此作為靶基因進行PCR檢測，也可避免檢測酶活性時出現的假陽性現象。這類文獻可以參考申請號為200910010798.7的中國發明專利申請公開《食品中金黃色葡萄球菌毒素基因的檢測試劑盒及檢測方法》(公開號為CN101580873A)，也可以參考申請號為200910041301.8的中國發明專利申請公開《金黃色葡萄球菌的多重PCR-MIX快速檢測試劑盒及檢測方法》(公開號為CN101613745A)。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是針對上述的技術現狀而提供一種自動化檢測的水產品中金黃色葡萄球菌的雙重PCR-DHPLC檢測方法，通過該方法還能同時判斷菌株致病性強弱。

本發明解決上述技術問題所采用的技術方案為：一種水產品中金黃色葡萄球菌的雙重PCR-DHPLC檢測方法，其特征在于包括如下步驟：

①金黃色葡萄球菌培養，將待測水產樣品與增菌液混合，進行培養；

②金葡菌基因組DNA的提取；

③引物的設計：

根據Genbank中金葡菌的sea和nuc基因序列，利用Primer5.0軟件設計2對特異性引物，如下：

sea-F：5’-AGTCTGAATTGCAGGGAAC-3’，

sea-R：5’-CACCACCATACATACAAGC-3’；

nuc-F：5’-CTTGCTATGATTGTGGTAGC-3’，

nuc-R：5’-CTAGCAAGTCCCTTTTCCAC-3’；

④以金葡菌基因組DNA為模板，進行雙重PCR擴增；

⑤PCR產物的DHPLC檢測，得到DHPLC峰型圖譜，供分析鑒定。

作為優選，步驟①中所述的金黃色葡萄球菌培養如下：取樣品1mL與10mL?10％氯化鈉胰酪胨大豆肉湯混合，于36℃±1℃培養18h～24h，其中，待測樣品與增菌液之間體積配比為1∶10。

作為優選，步驟①中所述的金葡菌基因組DNA的提取，如下：

取培養后的增菌液1mL，離心，去除上清，得到沉淀用溶葡菌酶進行預處理1h；然后按照細菌DNA提取試劑盒的說明書提取金葡菌基因組DNA。

作為優選，步驟④雙重PCR擴增條件如下：

雙重PCR反應體系：含20mM?Mg²⁺的10×PCR?Buffer?5μL，10mM的dNTP?2μL，兩對50μM的引物各0.5μL，2u·μL^-1的Ex?Taq酶1μL，模板DNA?2μL，最后用ddH₂O將反應總體積補足至50μL；

雙重PCR反應程序：95℃預變性5min；95℃變性45s，60℃退火1min，72℃延伸1min，35個循環，72℃延伸10min，4℃保存。

作為優選，步驟⑤中DHPLC檢測如下：